一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗及其构建方法与应用，属于免疫学领域和基因工程领域，以S蛋白为疫苗研发的免疫原(新冠病毒其它结构蛋白，如N蛋白或E蛋白或M蛋白同理)，以提高疫苗免疫后黏膜IgA表达水平为目的，构建了一套在S蛋白刺激机体免疫应答过程中可显著促进人体B淋巴细胞分泌特异性抗S蛋白IgA抗体进而增强黏膜保护与防御功能的新冠病毒新型疫苗，并提供了其构建技术、方法及应用。通过引入一簇特定的蛋白质结构域——IL

【技术实现步骤摘要】
一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于免疫学领域和基因工程领域，具体涉及一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]由新冠病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)感染引起的新冠肺炎，对人类健康和公共卫生安全构成了重大威胁，给人类带来了极为严峻的挑战。新冠病毒是一种有包膜的单股正链RNA病毒，基因组全长29903个碱基，编码约9860个氨基酸。病毒结构蛋白包括：刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein,E)、膜蛋白(membrane protein,M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)，结构蛋白基因占整个基因组开放阅读框的三分之一。其中S蛋白介导病毒识别宿主细胞受体，促进膜融合，并诱导免疫反应产生中和抗体。S蛋白包含S1、S2两个亚基，病毒感染细胞时，位于S1亚基上的受体结合域(RBD)与细胞膜上的血管紧张素转化酶(ACE2)受体结合，是新冠病毒中和抗原表位所在区域，介导病毒识别宿主细胞，因此，也是抗新冠病毒疫苗研发的最主要靶点；S2亚基则是介导病毒与宿主细胞之间的膜融合。
[0003]新冠疫情在全球范围的爆发给人类健康和社会经济带来了巨大的挑战，而疫苗接种是实现疫情有效控制的最主要途径。目前在全球范围内接种的新冠疫苗主要有灭活疫苗、mRNA疫苗、重组亚单位疫苗以及腺病毒载体疫苗。这些疫苗的接种，在一定程度上抑制住了病毒的传播和致病。然而，随着各地疫情的起伏转换，人们注意到了众多接种过疫苗的个体也可被新冠病毒再次感染，从而导致社会对疫苗的期待跌入谷底。分析疫苗接种后缺乏强效保护作用的原因，一般认为主要是病毒变异，特别是RBD区域突变所引起的抗原关键位点的变化，使原有的抗体无法识别突变了的RBD区域。变异因素虽然具有一定的理论和实践依据，但是，多数研究也证实，针对突变前RBD的抗体仍然可以识别并中和多数突变后的RBD。因此，并不能完全将疫苗接种后发生再次感染的原因完全归咎于病毒的变异。
[0004]黏膜系统，尤其是呼吸道黏膜是新冠病毒入侵机体的门户。随着对新冠病毒病原生物学研究的深入，在疫苗保护效应研究上，人们再次把目光聚焦在疫苗免疫效应与呼吸道黏膜免疫应答的相关性上，疫苗激发机体免疫系统产生的黏膜免疫应答水平是决定其保护效力及是否能预防再次感染的重要因素。换言之，疫苗激发的黏膜IgA分泌水平是关系到疫苗能否预防再次感染的关键因素。因此，基于提高IgA水平的疫苗研发是新型新冠疫苗研究的一个重要突破口。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的问题，本专利技术以S蛋白为疫苗研发的免疫原(新冠病毒其它结构蛋白，如N蛋白或E蛋白或M蛋白同理)，以提高疫苗免疫后黏膜IgA表达水平为目的，构建了一套在S蛋白刺激机体免疫应答过程中可显著促进人体B淋巴细胞分泌特异性抗S蛋白IgA抗
体进而增强黏膜保护与防御功能的新冠病毒新型疫苗，并提供了其构建技术、方法及应用。通过引入一簇特定的蛋白质结构域——IL
‑
5(称之为
‘
佐剂蛋白
’
)至新冠病毒的S蛋白，形成了一种
‘
佐剂蛋白
’
修饰的新冠病毒新型疫苗，其基因表达为信号肽基因
‑‑
佐剂蛋白基因
‑‑
连接子基因
‑‑
S蛋白基因的全长DNA如SEQ5所示。
[0006]‘
佐剂蛋白
’
对S蛋白的修饰包括：佐剂蛋白与S蛋白体外的直接偶联或化学偶联或通过第三方材料偶联、佐剂蛋白基因与S蛋白基因融合后的重组表达、佐剂蛋白与S蛋白溶液直接混合、佐剂蛋白基因与S蛋白基因融合后制备的mRNA疫苗。
[0007]本专利技术的有益效果是：
[0008]上述佐剂蛋白修饰的S蛋白即为本专利技术的新冠病毒新型疫苗，该疫苗接种机体后可刺激免疫系统产生特异性抗S蛋白的抗体，特别是可显著刺激特异性IgA抗体的表达与分泌，从而提高机体呼吸道黏膜抵御新冠病毒入侵的能力，改进目前一些疫苗接种后黏膜免疫应答不高、疫苗接种后仍可再次感染新冠病毒的不足。
附图说明
[0009]图1为实施例1中全长的
‘
信号肽基因
‑‑
佐剂蛋白(IL
‑
5)基因
‑‑
连接子基因
‑‑
RBD蛋白基因
’
DNA。
[0010]图2为本实施例1中融合蛋白免疫小鼠IgA水平测定结果。
[0011]图3为本实施例2中偶联蛋白免疫小鼠IgA水平测定结果。
[0012]图4为本实施例3中混合蛋白免疫小鼠IgA水平测定结果。
[0013]其中，**表示P<0.01(有显著统计学差异)，***表示P<0.001(有极其显著的统计学差异)，****表示P<0.0001(有极其显著的统计学差异)；ns表示无显著的统计学差异。
具体实施方式
[0014]为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案做进一步的描述。
[0015]实施例1
[0016]根据新冠病毒疫苗中S蛋白RBD(受体结合结构域)与佐剂蛋白(IL
‑
5)的基因序列，采用全基因合成的方法合成如图1所示DNA。
[0017]其中，信号肽采用人IL
‑
5的信号肽(SEQ1)，这里的信号肽不仅限于SEQ1所列出的序列，还包括所有常用的信号肽；佐剂蛋白(IL
‑
5)基因为115个氨基酸所对应的DNA(SEQ2)；连接子基因是连续的6个甘氨酸对应的碱基序列(SEQ3)；RBD蛋白为新冠病毒S蛋白中含有中和表位的一个结构域(SEQ4)。合成的
‘
信号肽基因
‑‑
IL
‑
5基因
‑‑
连接子基因
‑‑
RBD基因
’
全长DNA(SEQ5)克隆至PCDNA3.1真核表达载体，随后转染293T细胞。单独RBD对照为
‘
信号肽基因
‑‑
RBD基因
’
克隆PCDNA3.1真核表达载体，同方法转染293T细胞。
[0018]上述表达载体转染293T细胞后，收获细胞上清，表达蛋白并通过镍柱纯化，ELSIA及WB鉴定后用于小鼠免疫。A组小鼠免疫
‘
信号肽基因
‑‑
佐剂蛋白基因
‑‑
连接子基因
‑‑
RBD蛋白基因
’
表达的IL
‑5‑
RBD蛋白，4只小鼠，每只小鼠腹腔注射30μg；B组小鼠免疫
‘
信号肽基因
‑‑
RBD蛋白基因<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗，其特征在于，所述的疫苗是指在新冠病毒S蛋白中引入一簇特定的蛋白质结构域，即佐剂蛋白。2.根据权利要求1所述的一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗，其特征在于，所述的佐剂蛋白是一条含115个氨基酸的蛋白质，如SEQ6所示。3.一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗，其特征在于，所述的新冠病毒疫苗是指新冠病毒S蛋白基因与佐剂蛋白基因融合后重组表达的融合蛋白。4.根据权利要求3所述的一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗，其特征在于，新冠病毒S蛋白基因与佐剂蛋白基因融合过程为：S蛋白基因的5
’
端或3
’
端与佐剂蛋白基因的3
’
端或5
’
端通过柔性连接子进行基因水平的连接，连接后的基因结构为：信号肽基因
‑‑
佐剂蛋白基因
‑‑
连接子基因
‑‑
S蛋白基因或信号肽基因
‑‑
S蛋白基因
‑‑
连接子基因
‑‑
佐剂蛋白基因；此连接的基因所表达的重组蛋白为：佐剂蛋白或S蛋白的羧基端与连接子再与S蛋白或佐剂蛋白的氨基端连接的融合蛋白，即佐剂蛋白
‑‑
连接子肽
‑‑
S蛋白或S蛋白
‑‑
连接子肽
‑‑
佐剂蛋白。5.根据权利要求4所述的一种促进特异性IgA抗体分泌的新冠病毒疫苗，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：田易晓，黄庆生，王新月，邵东燕，杨慧，
申请(专利权)人：西北工业大学，
类型：发明
国别省市：