调节HGFβ链和C-MET的相互作用制造技术

本发明专利技术涉及调节ＨＧＦβ链和Ｃ－ＭＥＴ的相互作用。本发明专利技术提供用于调节ＨＧＦ／ｃ－ｍｅｔ信号途径的方法和组合物，具体通过调节ＨＧＦ链与ｃ－ｍｅｔ的结合。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总体涉及分子生物学以及生长因子调节领域。更具体地，本发 明涉及HGF/c-met信号途径的调节物，以及所述调节物的用途。
技术介绍
肝细胞生长因子(HGF)，也已知为分散因子(SF),是Met的配体(Bottaro et al., 1991)， Met是原癌基因编码的受体酪氨酸激酶(Cooper et al,, 1984a&b)。 HGF与Met的结合诱导细胞内激酶结构域的磷酸化，导致一系 列复杂细胞内途径的活化，导致多种细胞类型的细胞生长，分化和迁移； 多个最近公开的综述提供了全面的综述(Birchmeier et al,, 2003; Trusolino and Comoglio， 2002; Maulik et al., 2002)。除了其在胚胎发育和组织再生中的 根本重要性，HGF/Met信号途径也在浸润性肿瘤生长以及转移中起作用并 由此可代表感兴趣的治疗耙(Birchmeier et al.， 2003; Trusolino and Comoglio, 2002; Danilkovitch-Miagkova and Zbar， 2002; Ma et al., 2003)。HGF属于纤溶酶原相关的生长因子家族并包含含有N-末端指结构(N) 以及四个Kringle(Kl-K4)结构域的69 kDa a-链以及与来自Clan PA(S)/家族 SI的糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的蛋白酶结构域非常相似的34 kDa p-链 (Nakamura et al" 1989; Donate et al.， 1994; Rawlings et al" 2002)。与凝血酶原和其它丝氨酸蛋白酶酶原 一样，HGF作为单链前体形式分泌(scHGF) 。 scHGF 结合细胞表面上或细胞外基质中的疏酸乙酰肝素蛋白聚糖，诸如syndecan-l (Derksen et al.， 2002)。疏酸乙酰肝素蛋白聚糖结合N结构域(Hartmann et al.,1998) ,其对与位于K1中的氨基酸一起的高亲和力Met结合有贡献(Lokker etal.， 1994)。尽管scHGF能以高亲和力结合Met,它不能活化受体(Lokkeret al., 1992; Hartmann et al.， 1992)。获得HGF信号活性有赖于scHGF在 Arg494-Va1495的蛋白水解(活化)，所述蛋白水解导致成熟HGF这种二硫 键连接的a/|3异源二聚体形成(Lokker et al.， 1992; Hartmann et al., 1992; Naldinietal.， 1992)。 HGF (HGF卩-链)的蛋白酶样结构域缺乏催化活性，因为 它缺乏所需的Asp -His -Ser (所有方括号中均为标准糜蛋 白酶原编号)催化三联体，所述催化三联体可在所有具有Gln534 和 Tyr673 的丝氨酸蛋白酶中发现(Perona and Craik， 1995; Hedstrom， 2002)。由于其在调节HGF活性中的重要性，该过程必须由HGF转化酶及其相 应的生理抑制物严格控制。scHGF活化通过糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在体 外介导，所述糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶包括肝细胞生长因子活化物(HGFA) (Miyazawa et al.， 1993), matriptase/MT-SPl (Takeuchi et al. 1999; Lin et al.，1999) ,尿激酶型纤溶酶原激活物(Naldinietal., 1992)，因子XIIa (Shimomura et al., 1995),因子XIa (Peek et al., 2002)和血浆激肽释放酶(kallikrein)(Peek et al.,2002)。与scHGF类似，这些蛋白酶作为无活性前体产生；它们的酶活性 也由其它活化蛋白酶以及Kunitz-和serpin-型抑制物严格调节。已经描述了丝氨酸蛋白酶及其活化过程(Donateetal., 1994)。在丝氨酸 蛋白酶中，酶原的活化切割导致所谓的"活化结构域"的构象重排，导致 适当形成的活性位点以及底物/抑制物相互作用区。活化结构域构成三个表 面暴露的环(其分别称为-, -和-环)以及新形成的N末端 插入疏水袋子中(Huber and Bode, 1978)。在同源配体/受体对巨噬细胞刺激 蛋白(MSP)/Ron中，丝氨酸蛋白酶样MSP |3-链为受体结合提供主要的能量 (Wang etal" 1997; Miller and Leonard, 1998),这与HGF/Met系统相反，在该 系统中Met的高亲和力受体结合位点在HGF a-链中(Lokker et al.， 1994; Okigaki etal" 1992)。本专利技术所引用的所有参考文献，包括专利申请和公开，的全部内容包含在本文作为参考。
技术实现思路
凝血酶原-相关的生长因子肝细胞生长因子(HGF)结合其受体酪氨酸激 酶Met (本文也称为c-Met或c-met)，其参与肿瘤的进展，组织再生以及浸润 性肿瘤生长。HGF蛋白酶-样(3链的成功表达和纯化(在本文描述)，使得能 够明确确定HGF具体为HGF P-链与c-Met的相互作用的性质，其导致对 c-Met活化机制的更为清楚的理解。本专利技术中在经验上证明，丝氨酸蛋白酶 -样HGF |3-链本身与Met结合。反之，HGF |3的酶原-样形式的Met结合弱 得多，提示加工时构象改变导致的最佳相互作用。细胞迁移，Met磷酸化， HGF-依赖性细胞增殖和Met结合试验中检测的一组(3-链突变体显示，全长 HGF突变体的生物活性降低至少部分由于HGF P-链与Met的结合所致。功 能结合位点包括'活化结构域'和'活性位点区，，类似于丝氨酸蛋白酶的底 物加工位点。数据表示活化的(但不是酶原样形式的)p链可包括与另一 分子诸如另一HGFP链的最佳作用所需的界面，从而实现最大/最佳c-met 活化。本文所述的突变分析提供了设计跨效力镨抑制野生型HGF p链相互 作用的HGF突变体的基础。所述突变体的实例在本专利技术描述。这些突变体 能够与野生型HGF竟争与c-met的结合，但是实现c-met相关生物功能的能 力降低。这在完全和基本抑制HGF/c-met轴是不需要的情况下是尤其有利 的；这一点尤其受至!j关注，因为HGF和c-met 在正常细胞和组织中遍在表 达。这些突变体也可用作治疗病理疾病的优选治疗剂，其中需要降低的但 不是完全缺乏的HGF/c-met生物活性。本专利技术的方法和组合物总体基于这 些发现，其将在下文更详细描述。显示HGF p链以及其与c-met的相互作 用可为设计针对与异常和不需要的HGF/c-met途径的信号相关的病理疾病 的预防和/和治疗性方法中的更大调整的独特的并且是有利的靶。因此，本 专利技术提供了鉴定和利用能够调节HGF p链与c-met的结合来调节HGF/c-met 途径，以及用于调节HGF/c-met信号相关生物/生理活性的物质的方法，组 合物，试剂盒以及制 品0因此， 一方面，本专利技术提供筛选(或鉴定)选择性结合活化的肝细胞 生长因子卩链的物质的方法，所述方法包括(a)比较(本文档来自技高网...

【技术保护点】
筛选或鉴定选择性结合活化的肝细胞生长因子（ＨＧＦ）β链的物质的方法，所述方法包括：　比较（ｉ）候选物质与活化的ＨＧＦ　β链的结合，与（ｉｉ）候选物质与参比ＨＧＦ　β链的结合，其中所述参比β链基本上不结合ｃ－ｍｅｔ，　由此选择显示与活化的 ＨＧＦ　β链的结合亲和力高于与参比ＨＧＦ　β链的结合亲和力的候选物质，作为选择性结合活化的ＨＧＦ　β链的物质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔K克里切霍弗，罗伯特A拉扎勒斯，姚晓怡，
申请(专利权)人：健泰科生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]