HAND1重组蛋白及其制备方法和在治疗扩张性心肌病药物中的应用技术

本发明专利技术提供HAND1重组蛋白及其制备方法和在治疗扩张性心肌病药物中的应用。该HAND1重组蛋白的氨基酸序列如SEQ_1所示或者如SEQ_2所示。本发明专利技术还具体提供一种多克隆抗体，该抗体是以SEQ_1或者SEQ_2所示的HAND1重组蛋白作为抗原免疫实验级动物后获得。本发明专利技术利用成熟心肌细胞中过表达HAND1蛋白会导致心肌肥大的特点，设计合成了HAND1重组蛋白，该重组蛋白能够显著降低HAND1mRNA和蛋白表达量，抑制效果十分显著，显著优于其他siRNA，因此可开发为小分子药物，或研究扩心病病理机制的研发试剂。或研究扩心病病理机制的研发试剂。或研究扩心病病理机制的研发试剂。

【技术实现步骤摘要】
HAND1重组蛋白及其制备方法和在治疗扩张性心肌病药物中的应用


[0001]本专利技术具体涉及HAND1重组蛋白及其制备方法和在治疗扩张性心肌病药物中的应用。

技术介绍

[0002]扩张型心肌病(以下简称扩心病，DCM)是一种以收缩和舒张功能障碍为特征的心肌疾病，由心室功能受损，左心室扩张和舒张末期充盈压增加引起。主要表现为心力衰竭(以下简称心衰)、心律失常、栓塞等。扩心病具有遗传性，常常发生于不伴有其他疾病的年轻患者，患者病死率高，预后差。因此寻找可用于治疗扩心病的生物标志物非常重要。
[0003]导致扩心病病理改变的常见原因有特发性炎症，病毒感染和酒精等。目前针对这些病因常用治疗手段包括非药物治疗(患者训练，减少盐和水的摄入，适度的体育锻炼)和药物治疗(如：血管紧张素转换酶抑制剂(ACE
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I)/血管紧张素受体拮抗剂(ARB)，β受体阻滞剂，盐皮质激素(MR)拮抗剂)。随着病情进展，当患者的药物使用量已达最大耐受值，但LVEF仍≤35％时，依据《中国扩张型心肌病诊断和治疗指南》所示：CRT植入和原位心脏移植成为此时的主流治疗方式。然而不幸的是，尽管有确凿的证据，但主要障碍仍然是CRT的使用不足和供体器官持续短缺。所以急需寻找新的治疗手段。值得注意的是在所有DCM病例中，有35％的DCM病例可以识别基因突变。这提示基因治疗可能成为治愈扩心病的新方向。
[0004]染色质的基本元素核小体由DNA与组蛋白缠绕形成，组蛋白不同位点被修饰后可对基因表达发挥不同的作用，H3K27ac是常见的活跃组蛋白修饰，它使DNA结构变得疏松，从而有利于转录。申请人最近的研究发现DCM中富含的H3K27ac环锚结构对HAND1表现出强烈富集。HAND1作为基本螺旋
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环
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螺旋转录因子家族的重要成员，已被证实为小鼠胚胎心脏发生和出生后心室结构重塑所必需，一般在发育成熟的小鼠体内停止表达，若此时HAND1异常表达反而导致DCM。
[0005]本研究结果表明HAND1可以作为扩心病的潜在治疗靶标。然而筛查Selleck chemical library没有发现HAND1抑制剂，且现有文献中抑制HAND1常用的方法为siRNA
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HAND1，但siRNA
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HAND1对HAND1的敲降效果一般。综上所述，鉴于目前未见HAND1蛋白酶抑制剂在治疗扩心病方面的报道，以及HAND1在扩心病治疗上的潜力，有必要对这些疑问展开深入研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供HAND1重组蛋白及其制备方法和在治疗扩张性心肌病药物中的应用。
[0007]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0008]第一方面，本专利技术提供一种HAND1重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ_1所示或者如SEQ_2所示。
[0009]第二方面，本专利技术提供SEQ_1所示的HAND1重组蛋白的制备方法，包括：
[0010]步骤1，选择HAND1基因中18
‑
102aa区间蛋白片段的编码核酸序列，设计引物对所述核酸序列进行克隆，构建重组原核表达载体；
[0011]步骤2，将步骤1获得的重组原核表达载体转化表达细胞进行蛋白表达，纯化后获得SEQ_1所示的HAND1重组蛋白。
[0012]优选地，所述重组原核表达载体为pGEX4T
‑
AB1或者pET
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28a
‑
SUMO。
[0013]优选地，针对重组原核表达载体pGEX4T
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AB1的引物对为：SEQ_3所示的WG
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03542D
‑
E
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4T
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AB1
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F，SEQ_4所示的WG
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03542D
‑
X
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4T
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AB1
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R；针对重组原核表达载体pET
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28a
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SUMO的引物对为：SEQ_5所示的WG
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03542D
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B
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SUMO
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F，SEQ_6所示的WG
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03542D
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H
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SUMO
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R。
[0014]第三方面，本专利技术提供SEQ_2所示的HAND1重组蛋白的制备方法，包括：
[0015]步骤1，选择HAND1基因中182
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197aa区间蛋白合成多肽C
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QQHEGFPPALGPVEKR；
[0016]步骤2，将所述多肽偶联到血蓝蛋白，得到SEQ_2所示的HAND1重组蛋白。
[0017]第四方面，本专利技术提供一种多克隆抗体，该抗体是以SEQ_1或者SEQ_2所示的HAND1重组蛋白作为抗原免疫实验级动物后获得。
[0018]优选地，所述多克隆抗体的制备方法，包括：
[0019]将SEQ_1或者SEQ_2所示的HAND1重组蛋白作为抗原进行动物免疫诱导抗体产生，再对获得的抗体进行纯化，即得。
[0020]优选地，所述将HAND1重组蛋白作为抗原进行动物免疫诱导抗体产生的过程包括：分别在第1天、第12天、第26天、第40天、第54天对实验动物进行免疫，第1天的免疫剂量为0.3mg，其余时间点的免疫剂量为0.15mg；在第66天对免疫动物采血。
[0021]第五方面，本专利技术提供上述HAND1重组蛋白或者上述多克隆抗体在制备治疗扩心病药物中的应用。
[0022]第六方面，本专利技术提供一种治疗扩心病的药物，包括上述HAND1重组蛋白或者上述多克隆抗体，已经药学上可接受的载体。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术利用成熟心肌细胞中过表达HAND1蛋白会导致心肌肥大的特点，设计合成了HAND1重组蛋白，该重组蛋白：
[0024]1.能够显著降低HAND1 mRNA和蛋白表达量，抑制效果十分显著，显著优于其他siRNA，因此可开发为小分子药物，或研究扩心病病理机制的研发试剂。
[0025]2.相比于之前实验中常用的HAND1
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siRNA抑制HAND1表达的方式，本专利技术合成的HAND1重组蛋白具有更高效的抑制作用，避免了慢病毒载体对受试者的侵害，从而使临床运用HAND1治疗扩心病成为可能。
附图说明
[0026]图1为实施例1中HAND1(18
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102aa)基因PCR扩增产物电泳鉴定结果。
[0027]图2为实施例1中HAND1大肠杆菌表达后的PAGE凝胶电泳图，大小在30KD，其中，1表示Pet
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28a
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SUMO
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HAND1(18
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HAND1重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ_1所示或者如SEQ_2所示。2.SEQ_1所示的HAND1重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括：步骤1，选择HAND1基因中18
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102aa区间蛋白片段的编码核酸序列，设计引物对前述的蛋白片段进行克隆，构建重组原核表达载体；步骤2，将步骤1获得的重组原核表达载体转化表达细胞进行蛋白表达，纯化后获得HAND1重组蛋白。3.根据权利要求2所述的HAND1重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述重组原核表达载体为pGEX4T
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AB1或者pET
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28a
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SUMO。4.根据权利要求3所述的HAND1重组蛋白的制备方法，其特征在于：针对重组原核表达载体pGEX4T
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AB1的引物对为：SEQ_3所示的WG
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03542D
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E
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4T
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AB1
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F，SEQ_4所示的WG
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03542D
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X
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4T
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AB1
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R；针对重组原核表达载体pET
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28a
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SUMO的引物对为：SEQ_5所示的WG
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03542D
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B...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋磊，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：