一种牛IgGFc受体boFcγRII的线性配体结合表位制造技术

本发明专利技术涉及一种牛IgG Fc受体boFcγRII的线性配体结合表位，该表位序列为FYQDRKSKIF，位于boFcγRII第2胞外结构域EC2的C

【技术实现步骤摘要】
一种牛IgG Fc受体boFc
γ
RII的线性配体结合表位


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种细胞表面受体的配体结合表位，特别是涉及一种牛IgG Fc受体boFcγRII的线性配体结合表位。

技术介绍

[0002]IgG Fc受体(FcγR)是结合免疫球蛋白G恒定区(Fc)的细胞表面受体，广泛表达于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞(DC)、B细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞等免疫细胞表面，它们通过与IgG Fc区的相互作用在体液和细胞免疫反应中发挥关键作用，成为开发针对自身免疫性疾病、传染性疾病和肿瘤的新型免疫治疗的潜在靶标。人类已鉴定了三种不同类别的受体FcγRI(CD64)、FcγRIIA/B/C(CD32)和FcγRIIIA/B(CD16)，在小鼠中发现了第四类受体FcγRIV，其中FcγRII是IgG的低亲和力受体，具有EC1和EC2两个胞外Ig样结构域，在生理条件下只能结合IgG复合物或多聚体，不能结合IgG单体。huFcγRIIA或huFcγRIIB胞外结构域与IgG1 Fc复合物的晶体结构显示，低亲和力FcγRII的EC2结构域结合在IgG同源二聚体Fc区的马蹄形开口，提示可用于设计抑制IgG与FcγRII结合的多肽分子。事实上，来自人IgG的多肽已表现出与FcγRII相结合的能力。因此，我们以为源于低亲和力FcγR的Fc结合位点多肽将是调控Fc受体引发炎症反应的理想候选者。
[0003]在家养动物中，牛、猪和绵羊的FcγRII已分别得到克隆鉴定，牛FcγRII(boFcγRII)cDNA包含一个编码296aa受体蛋白ORF(888nt)，前42aa为具有明显疏水特征的信号肽，胞外区由181aa组成，4个Cys均匀分布构成两个Ig样结构域，是配体结合的功能区。boFcγRII蛋白骨架的分子量为28kDa，而分布于37、44、63、137和144位的5个N糖基化位点的糖基化可使表观分子量增到43
‑
48kDa。boFcγRII与人和小鼠FcγRIIB高度同源，核苷酸同源性为74％和68％，氨基酸同源性为59％和55％。boFcγRII转染的COS7细胞只与牛IgG1致敏红细胞结合，而不结合牛IgG2致敏红细胞，表明boFcγRII特异亲和牛IgG1。然而，boFcγRII在细胞中的表达与分布，以及受体与IgG相互作用等尚未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术筛选鉴定出boFcγRII的线性配体结合表位及其关键氨基酸，分析线性配体结合表位多肽与牛IgG1的特异结合，探讨表位多肽对IgG
‑
boFcγRII相互作用的调控作用，为IgG Fc受体靶向药物开发提供了新思路。
[0005]本专利技术的技术方案：
[0006]一种牛IgG Fc受体boFcγRII的线性配体结合表位，其特征是：所述表位的序列为FYQDRKSKIF。
[0007]所述表位位于boFcγRII第2胞外结构域EC2的C
‑
C
’
环的122
‑
131位。
[0008]所述线性配体结合表位特异结合牛IgG1抗体，但不结合牛IgG2抗体。
[0009]所述线性配体结合表位的Phe
122
、Tyr
123
、Arg
126
、Lys
127
、Ser
128
、Lys
129
和Phe
131
为结合牛IgG1的关键氨基酸残基，突变其中任一氨基酸，导致线性配体结合表位多肽丧失结合
牛IgG1的能力。
[0010]所述线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1抗体与boFcγRII重组蛋白的结合，其半数抑制浓度为20.05μmol/L。
[0011]所述线性配体结合表位能有效抑制牛IgG1抗体与细胞表面表达的boFcγRII受体结合，其半数抑制浓度为80.15μmol/L。
[0012]所述的线性配体结合表位在FcγR靶向药物制备中的应用。
[0013]本申请将boFcγRII编码区cDNA亚克隆到表达载体pcDNA3，在COS
‑
7细胞表面表达受体分子，通过玫瑰花环试验测定boFcγRII的配体特异性，IgG1
‑
RBC在boFcγRII转染细胞上形成明显的玫瑰花环，但未发现IgG2
‑
RBC结合，表明boFcγRII特异亲和牛IgG1而不结合牛IgG2。
[0014]将boFcγRII胞外区cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3，在NS0细胞中分泌表达boFcγRII胞外区，诱导小鼠腹水并纯化boFcγRII重组蛋白。
[0015]在boFcγRII的EC2结构域设计合成boFcγRII多肽，以Dot
‑
blot筛选获得特异结合牛IgG1但不结合牛IgG2的最短有效多肽122
‑
131位FYQDRKSKIF，为boFcγRII的线性配体结合表位，位于受体EC2结构域C
‑
C
’
环；多肽突变分析表明，boFcγRII线性配体结合表位的Phe
122
、Tyr
123
、Arg
126
、Lys
127
、Ser
128
、Lys
129
和Phe
131
是结合牛IgG1的关键氨基酸残基，突变其中任一氨基酸导致线性配体结合表位多肽丧失结合牛IgG1的能力。
[0016]本专利技术的积极有益效果：
[0017]本专利技术通过在COS
‑
7细胞表面表达boFcγRII受体分子，利用合成多肽筛选鉴定boFcγRII的线性配体结合表位，对深入理解为IgG
‑
boFcγRII相互作用有重要意义。
[0018](1)IgG Fc受体功能研究。本申请构建boFcγRII全长cDNA的真核表达质粒，将其转染COS
‑
7细胞并通过G418筛选，在细胞表面表达boFcγRII分子，构建了boFcγRII功能研究平台。
[0019](2)线性配体结合表位鉴定。参照人FcγRII
‑
IgG复合物晶体结构，设计合成boFcγRII胞外结构域多肽，将多肽偶联载体蛋白，以Dot
‑
blot筛选鉴定与IgG特异结合多肽，建立boFcγRII线性配体结合表位鉴定方法。
[0020](3)表位多肽功能分析。本申请利用boFcγRII重组蛋白和HRP标记IgG1，建立表位多肽的阻断ELISA方法，分析表位多肽对boFcγRII重组蛋白与牛IgG结合的抑制作用；利用boFcγRII转染细胞和牛IgG1致敏红细胞，建立玫瑰花环抑制试验，分析表位多肽对细胞表面表达boFcγRII与牛IgG结合的调控作用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛IgG Fc受体boFcγRII的线性配体结合表位，其特征是：所述表位的序列为FYQDRKSKIF。2.根据权利要求1所述的的线性配体结合表位，其特征是：所述表位位于boFcγRII第2胞外结构域EC2的C
‑
C
’
环的122
‑
131位。3.根据权利要求1所述的的线性配体结合表位，其特征是：所述线性配体结合表位特异结合牛IgG1抗体，但不结合牛IgG2抗体。4.根据权利要求1所述的的线性配体结合表位，其特征是：所述线性配体结合表位的Phe
122
、Tyr
123
、Arg
126
、Lys
127...

【专利技术属性】
技术研发人员：李青梅，郭军庆，张改平，乔松林，杨继飞，赵东，王丽，柴书军，邢广旭，
申请(专利权)人：河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，
类型：发明
国别省市：