用于神经系统疾病的组合物和方法技术方案

提供了用于调节细胞的活性的组合物和方法，其使用工程化受体、多核苷酸编码的工程化受体和包含编码工程化受体的多核苷酸的基因疗法载体。这些组合物和方法特别地可用于调节神经元的活性，例如在疾病的治疗中或在神经元回路的研究中。回路的研究中。回路的研究中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于神经系统疾病的组合物和方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2020年8月21日提交的美国临时申请号63/068,890的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。电子提交的文本文件的说明
[0002]与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且通过引用特此并入本说明书。含有序列表的文本文件的名称是SWCH_034_01WO_SeqList_ST25.txt。所述文本文件的大小为约297kb，创建于2021年8月19日，并且通过EFS
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Web以电子方式提交。


[0003]本公开文本涉及工程化受体以及工程化受体和小分子配体用于调节细胞活性并治疗疾病的用途。

技术介绍

[0004]顽固性神经系统疾病经常与异常地起作用的神经元相关联。与所述疾病相关联的易处理的靶蛋白的缺乏已经阻碍了开发用于治疗这些病症的疗法的尝试。例如，在美国和世界范围内，无法缓解的慢性疼痛是一个严重的健康问题。医学研究所(Institute of Medicine)的一份报告估计，1.16亿美国人患有持续数周至数年的疼痛，导致每年超过5600亿美元的费用。对于慢性疼痛患者，没有适当的长期疗法，这给社会和个人都带来了巨大的费用。疼痛经常导致残疾，而且即使没有残疾，也会对生活质量产生深远影响。即使在诸如以下的最佳护理服务情况下时，疼痛治疗也常常失败：医师关怀备至，训练有素；随时可获得阿片类物质；使用辅助镇痛药；患者控制的镇痛的可获得性；以及如神经传导阻滞和IT泵等程序的基于证据的使用。
[0005]关于慢性疼痛最常用的疗法是应用阿片类镇痛剂和非甾体类抗炎药，但这些药物会导致成瘾并可能引起副作用，诸如药物依赖性、耐受性、呼吸抑制、镇静、认知失败、幻觉以及其他全身性副作用。尽管广泛使用药物，但其在缓解疼痛的有效性方面成功率非常低。使用各种药物的大型随机研究发现，每两或三名患者中只有一名实现了至少50％的疼痛缓解(Finnerup等人,2005)。使用最先进的药理学治疗的随访研究发现了相同的结果，表明用于疼痛的药物的功效没有改善(Finnerup等人,Pain,150(3):573
‑
81,2010)。
[0006]用于治疗疼痛的侵入性更高的选择包括神经传导阻滞和电刺激。神经传导阻滞是通常在脊髓中的局部麻醉剂注射，以中断到脑的疼痛信号，其作用仅持续数周至数月。在大多数情况下，神经阻滞不是推荐的治疗选择(Mailis和Taenzer,Pain Res Manag.17(3):150
‑
158,2012)。电刺激涉及提供电流以阻断疼痛信号。尽管作用可能比神经阻滞持续得更久，但电引线本身会引起并发症：脱位、感染、破裂或电池没电。一项综述发现，用电刺激治疗神经病变的患者中的40％经历了这些装置问题中的一个或多个(Wolter,2014)。
[0007]用于管理疼痛的侵入性最高且最不受欢迎的方法是通过手术完全去除引起疼痛的神经或其部分。仅当患者已用尽前述和其他侵入性更低的治疗并发现它们无效时，才推
荐此选择。射频神经消融使用热来破坏有问题的神经并且提供比神经阻滞更久的疼痛缓解。但是，一项研究发现，在用于慢性腰骶神经根痛的DRG部分射频毁损中，在对照组与治疗组之间没有差异(Geurts等人,2003)。用于手术去除疼痛神经的其他手术方法具有类似的缺点并且具有长期的严重副作用(包括感觉或运动缺陷)或在其他地方引起疼痛。
[0008]用于治疗神经系统障碍的方法应当是安全的、高效的和有成本效益的。基因疗法可以为多种神经系统疾病提供非侵入性治疗选择，包括管理疼痛。但是，迄今为止，基因疗法尚未广泛用于治疗神经系统疾病。本公开文本解决了这些需求。
附图说明
[0009]当结合附图阅读时，从以下具体实施方式最好地理解本公开文本。本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。应当强调的是，根据通常实践，附图的各个特征不是按比例绘制。相反，为了清楚起见，各个特征的尺寸被任意放大或缩小。附图中包括以下图：
[0010]图1A
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图1J示出了在被不同剂量的乙酰胆碱或指示的非天然配体刺激后，工程化嵌合受体SEQ ID NO:33的突变体中YFP荧光的淬灭百分比的热图，所述突变体包含指示的氨基酸取代。配体剂量写在每个图表的顶部。框中的数字指示观察到的淬灭的相对量。更高水平的淬灭表明在指示的剂量下配体对受体更高水平的激活。淬灭水平还由颜色梯度指示。深色＝大于YFP报告物的最大淬灭的70％(即，大多数工程化受体被激活)。白色＝淬灭小于10％(即，几乎没有工程化受体被激活)。负值表示由于刺激伪像而具有阴性淬灭的无反应者。SEQ ID NO:29是用作阴性对照的无反应嵌合体。CODA283含有在克隆期间引入的额外N379K突变，其位于配体结合结构域之外，并且因此不影响配体结合。图1A示出了使用乙酰胆碱的YFP荧光淬灭；图1B示出了使用CNL001的YFP荧光淬灭；图1C示出了使用TC
‑
6683的YFP荧光淬灭；图1D示出了使用TC
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5619/布丹克林(Bradanicline)的YFP荧光淬灭；图1E示出了使用CNL002的YFP荧光淬灭；图1F示出了使用ABT
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126的YFP荧光淬灭；图1G示出了使用AZD
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0328的YFP荧光淬灭；图1H示出了使用伐西尼克林(Facinicline)的YFP荧光淬灭；图1I示出了使用TC
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6987的YFP荧光淬灭；图1J示出了使用瓦伦尼克林的YFP荧光淬灭。非天然配体名称的缩写：abt：ABT
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126；ach：乙酰胆碱；azd：AZD
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0328；brd：TC
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5619(布丹克林)；fac：RG3487(伐西尼克林)；tc6：TC
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6987；var：瓦伦尼克林。
[0011]图2A
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图2B示出了在HEK 293细胞中表达的CR
‑
11(化学成因(Chemogenic)受体
‑
11，一种工程化受体，其包含具有在SEQ ID NO:33中的Y115D和L131Q氨基酸取代的氨基酸序列)对乙酰胆碱以及对非天然配体RG
‑
3487(SA
‑
2，合成激动剂
‑
2)的浓度
‑
反应曲线。使用手动膜片钳电生理学评价反应。将电流针对一归一化以获得最大反应。穿过数据点的实线是用希尔方程获得的最佳拟合，并且从浓度
‑
反应曲线估计每种配体的EC
50
。图2A示出了野生型和CR
‑
11受体对乙酰胆碱的浓度
‑
反应曲线。图2B示出了野生型和CR
‑
11受体对RG
‑
3487(SA
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2)的浓度
‑
反应曲线。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种工程化受体，所述工程化受体包含来源于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
‑
nAChR)的配体结合结构域，其中所述配体结合结构域包含在对应于SEQ ID NO:4的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172或Y210的氨基酸残基处的氨基酸突变。2.根据权利要求1所述的工程化受体，其中所述配体结合结构域包含与SEQ ID NO:4的氨基酸残基23
‑
220具有至少85％同一性的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的工程化受体，其中所述配体结合结构域包含在选自对应于SEQ ID NO:4的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172和Y210的那些氨基酸残基的两个或更多个氨基酸残基处的氨基酸突变。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的工程化受体，其中所述配体结合结构域包含在对应于SEQ ID NO:4的指示位置的一个或多个氨基酸残基处的突变：a)Y140；b)R101和L131；c)Y115和Y210；d)R101和Y210；e)R101、Y115和Y210；f)W77、R101和L131；g)R101、L131和S172；h)Q139和S172D；i)S172和Y210j)L131和S172；k)Y115和S170；或l)Y115和L131。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的工程化受体，其中所述突变是氨基酸取代。6.根据权利要求4所述的工程化受体，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:4的指示位置的一个或多个氨基酸取代：a)Y140I；b)R101F和L131G；c)R101F和L131D；d)Y115E和Y210W；e)R101W和Y210V；f)R101F和Y210V；g)R101F和Y210F；h)R101M和L131A；i)R101M和L131F；j)R101W、Y115E和Y210W；k)R101F、Y115E和Y210W；l)W77F、R101F和L131D；m)R101F、L131N和S172D；n)Q139E和S172D；
o)S172D和Y210W；p)L131S和S172D；q)L131T和S172D；r)L131D和S172D；s)Y115D和S170T；t)Y115D和L131Q；u)Y115D和L131E；v)L131E；w)Y140C；x)R101W；y)Y210V；或z)Q139E。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体是嵌合配体门控离子通道(LGIC)受体，其包含来源于人甘氨酸受体的离子孔结构域。8.根据权利要求7所述的工程化受体，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1、人甘氨酸受体α2或人甘氨酸受体α3。9.根据权利要求7所述的工程化受体，其中所述离子孔结构域包含与SEQ ID NO:2的氨基酸255
‑
457、SEQ ID NO:83的260
‑
452、SEQ ID NO:85的氨基酸259
‑
464或SEQ ID NO:87的氨基酸259
‑
449具有至少85％同一性的氨基酸序列。10.根据权利要求7
‑
9中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含来源于所述人甘氨酸受体的Cys
‑
环结构域。11.根据权利要求10所述的工程化受体，其中所述Cys
‑
环结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸166
‑
172。12.根据权利要求10所述的工程化受体，其中所述Cys
‑
环结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸166
‑
180。13.根据权利要求1
‑
12中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体的配体结合结构域包含来自人甘氨酸受体α1亚基的β1
‑
2环结构域。14.根据权利要求13所述的工程化受体，其中所述β1
‑
2环结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸81
‑
84。15.根据权利要求1
‑
14中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体包含根据SEQ ID NO:58
‑
78和88中任一个的氨基酸序列。16.一种工程化嵌合配体门控离子通道(LGIC)，所述工程化嵌合LGIC包含来源于第一LGIC的配体结合结构域和来源于第二LGIC的离子孔结构域，其中所述第一LGIC是人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
‑
nAChR)并且包含在对应于SEQ ID NO:4的W77、R101、Y115、L131、Q139、Y140、S170、S172或Y210的氨基酸残基处的氨基酸突变。17.根据权利要求16所述的工程化嵌合LGIC，其中所述配体结合结构域包含在对应于SEQ ID NO:4的指示位置的一个或多个氨基酸残基处的突变：a.Y140；b.R101和L131；
c.Y115和Y210；d.R101和Y210；e.R101、Y115和Y210；f.W77、R101和L131；g.R101、L131和S172；h.Q139和S172D；i.S172和Y210j.L131和S172；k.Y115和S170；或l.Y115和L131。18.根据权利要求16所述的工程化嵌合LGIC，其中所述配体结合结构域包含对应于SEQ ID NO:4的指示位置的一个或多个氨基酸取代：a.Y140I；b.R101F和L131G；c.R101F和L131D；d.Y115E和Y210W；e.R101W和Y210V；f.R101F和Y210V；g.R101F和Y210F；h.R101M和L131A；i.R101M和L131F；j.R101W、Y115E和Y210W；k.R101F、Y115E和Y210W；l.W77F、R101F和L131D；m.R101F、L131N和S172D；n.Q139E和S172D；o.S172D和Y210W；p.L131S和S172D；q.L131T和S172D；r.L131D和S172D；s.Y115D和S170T；t.Y115D和L131Q；u.Y115D和L131E；v.L131E；w.Y140C；x.R101W；y.Y210V；或z.Q139E。19.根据权利要求16
‑
18中任一项所述的工程化嵌合LGIC，其中所述第二LGIC是人甘氨
酸受体。20.根据权利要求19所述的工程化嵌合LGIC，其中所述人甘氨酸受体是人甘氨酸受体α1。21.根据权利要求20所述的工程化嵌合LGIC，所述工程化嵌合LGIC包含与SEQ ID NO:33具有至少85％序列同一性的多肽序列。22.根据权利要求1
‑
21中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体对乙酰胆碱的效力低于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
‑
nAChR)或对照受体对乙酰胆碱的效力。23.根据权利要求22所述的工程化受体，其中所述工程化受体对乙酰胆碱的效力比人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
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nAChR)或对照受体对乙酰胆碱的效力低至少2倍。24.根据权利要求1
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23中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体对非天然配体的效力与人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
‑
nAChR)或对照受体对所述非天然配体的效力大致相同。25.根据权利要求1
‑
24中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体对非天然受体的效力高于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
‑
nAChR)或对照受体对所述非天然受体的效力。26.根据权利要求25所述的工程化受体，其中所述工程化受体对所述非天然受体的效力比人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
‑
nAChR)或对照受体对所述非天然受体的效力高至少2倍。27.根据权利要求22
‑
26中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体对配体的效力是根据YFP荧光淬灭测定使用Lenti
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X 293T细胞通过所述受体对所述配体的EC50来确定。28.根据权利要求1
‑
27中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体在存在非天然配体的情况下的功效高于人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
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nAChR)或对照受体在存在所述非天然配体的情况下的功效。29.根据权利要求1
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28中任一项所述的工程化受体，其中所述工程化受体在存在非天然配体的情况下的功效比人α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7
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nAChR)或对照受体在存在所述非天然配体的情况下的功效高至少2倍。30.根据权利要求28
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29中任一项所述的工程化受体，其中确定功效包括在存在所述非天然配体的情况下体外确定穿过所述工程化受体的电流量。31.根据权利要求24
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30中任一项所述的工程化受体，其中所述非天然配体选自AZD
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0328、TC
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6987、ABT
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126、CNL002、TC
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5619、CNL001、TC
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6683、瓦伦尼克林和伐西尼克林/RG3487。32.根据权利要求31所述的工程化受体，其中所述非天然配体选自ABT
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126、RG3487和CNL002。33.根据权利要求31所述的工程化受体，其中所述非天然配体是TC
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5619。34.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据权利要求1
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33中任一项所述的工程化受体。35.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:58
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78和88中任一个的氨基酸序列的工程化受体。36.根据权利要求34或35所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含可操作地连接至编码所述工程化受体的核酸的启动子。
37.根据权利要求36所述的多核苷酸，其中所述启动子是调节型启动子。38.根据权利要求37所述的多核苷酸，其中所述调节型启动子在可兴奋细胞中是有活性的。39.根据权利要求38所述的多核苷酸，其中所述可兴奋细胞是神经元或肌细胞。40.根据权利要求39所述的多核苷酸，其中所述可兴奋细胞是神经元。41.一种载体，所述载体包含根据权利要求34
‑
40中任一项所述的多核苷酸。42.根据权利要求41所述的载体，其中所述载体是质粒或病毒载体。43.根据权利要求42所述的载体，其中所述载体是选自腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体和单纯疱疹
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1病毒载体(HSV
‑
1)的病毒载体。44.根据权利要求43所述的载体，其中所述病毒载体是AVV载体，并且其中所述AAV载体是AAV5或其变体、AAV6或其变体或AAV9或其变体。45.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1
‑
33中任一项所述的工程化受体、根据权利要求34
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40中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求41
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44中任一项所述的载体。46.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1
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33中任一项所述的工程化受体、根据权利要求34
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40中任一项所述的多核苷酸或根据权利要求41
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44中任一项所述的载体以及药学上可接受的载体。47.一种在神经元中表达工程化受体的方法，所述方法包括使所述神经元与根据权利要求34
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40中任一项所述的多核苷酸、根据权利要求41
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44中任一项所述的载体、根据权利要求45所述的组合物或根据权利要求46所述的药物组合物接触。48.根据权利要求47所述的方法或根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述神经元是外周神经系统的神经元。49.根据权利要求47或48所述的方法或根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述神经元是中枢神经系统的神经元。50.根据权利要求47
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49中任一项所述的方法或根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述神经元是伤害感受性神经元。51.根据权利要求47
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50中任一项所述的方法或根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述神经元是非伤害感受性神经元。52.根据权利要求47
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51中任一项所述的方法或根据权利要求40所述的多核苷酸，其中所述神经元是背根神经节(DRG)神经元、三叉神经节(TG)神经元、运动神经元、兴奋性神经元、抑制性...

【专利技术属性】
技术研发人员：小安东尼，
申请(专利权)人：特拉梅斯生物公司，
类型：发明
国别省市：