一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的分子标记及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的分子标记及应用，所述分子标记是特异性分子标记，位于CTB4a编码基因的SNP

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的分子标记及应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，涉及用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用


技术介绍

[0002]水稻冷害是指在持续一段时间内，水稻遭遇植株正常生长发育最低临界温度以下的温度时所造成的影响。根据水稻遭遇冷害时的生育期将冷害分为芽期冷害、苗期冷害、孕穗开花期冷害、灌浆期冷害。其中，孕穗开花期是对低温最为敏感的时期，此时正常生长发育的最低临界温度为18℃，其受害程度与抽穗前9
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11天的平均气温有关，低温造成的损失最大，制约着水稻高产稳产。研究表明随着低温时间及低温强度的增加，水稻的减产率在显著增加。
[0003]目前已报道的在水稻12条染色体上共检测到270多个耐冷QTL，其中孕穗期克隆的耐冷基因共有五个，bZIP73，Ctb1，CTB2，CTB4a，CTB4b。其中，CTB4a由温带粳稻在低温环境下驯化产生；该基因编码一个蛋白激酶，可使植株低温条件下产生更多ATP，以维持维持耐冷性；低温条件下该基因的高表达单倍型可使水稻花粉育性、结实率和产量都显著提高，该基因的耐冷单倍型在云南地方种质昆明小白谷（Kunming Xiaobaigu，KMXBG）中克隆得到，并存在于丽江新团黑谷、寒地粳稻东农428和稻花香等耐冷性强的品种中。CTB4a对孕穗期的水稻植株耐冷性具有剂量效应，其耐冷单倍型启动子区包含所有5个一致SNPs，其中，SNP
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2536（A/G）、SNP
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2511（T/C）和SNP
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1930（G/C）是功能性SNPs（FNPs），可解释CTB4a等位基因表达水平的差异。而在已测水稻水稻材料中，这三个碱基中只有SNP
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1930处的功能碱基G在耐冷单倍型CTB4a中存在。
[0004]传统的水稻抗性育种是通过抗性鉴定对植株进行表型选择，耗费时间长，且易受环境条件的限制，鉴定结果容易造成误差，选择效率较低。利用分子标记辅助育种(Molecular Marker－assisted Selection，MAS)简单有效，可以降低育种成本，缩短选育周期。当今水稻耐冷育种的主要问题是可应用的耐冷基因太少，检测水稻耐冷基因，了解不同水稻品种的耐冷遗传背景，可以减少耐冷性育种工作的盲目性，提高育种效率，因此用基因特异性分子标记对水稻品种资源进行耐逆基因的鉴定十分重要。开发CTB4a特异分子标记，将有助于水稻育种家在育种过程中为分子设计育种改良水稻抗逆性提供理论依据，最终实现高效育种，带来巨大的社会经济效益。
[0005]对比文件及简单说明：（1）一种水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4a及编码基因与应用 CN 107118264 B对比文件（1）主要明确了CTB4a的基因蛋白序列及编码序列；本专利技术主要提供一种新的CTB4a的检测方法，本专利技术所涉及的检测位点及相应引物序列不在对比文件核酸及蛋白序列的保护范围内。
[0006]（2）用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用 CN 110878375 A对比文件（2）针对的SNP位点存在于CTB4a的编码区范围内，所使用的方法为KASP；
本专利技术针对的位点为启动子区域
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1930bp 的SNP，所使用的方法为酶切扩增多态性序列（CAPS）。两者针对位点不一样，涉及检测方法也不一样。
[0007]（3）Natural variation in CTB4a enhances rice adaptation to cold habitats. Nat Commun. 2017 Mar 23;8:14788. doi:10.1038/ncomms14788. PMID: 28332574; PMCID: PMC5376651.对比文件（3）中提出了SNP
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1930作为CTB4a的功能性位点，但是对比文件中对该位点的检测是结合基因芯片及Sanger测序法获得；本专利技术针对SNP
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1930位点的多态性设计了新的特异性分子标记位点，其对限制性内切酶及扩增引物的使用具有创新性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是提供一种用于检测耐冷基因CTB4a的特异性分子标记及应用。
[0009]为实现本专利技术的目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，位于CTB4a编码基因的SNP
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1930处。
[0010]所述该SNP位点碱基有2种情况：多态性为G/C；若该位点处碱基为G，则待测水稻材料具有耐冷性基因CTB4a，若该位点处碱基为C，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。
[0011]所述的特异分子标价可以使用一组引物组合来检测，所述引物组合包括引物ctb4a
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1930 F和ctb4a
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1930 R，以及限制性内切酶HindⅢ。
[0012]含有上述引物组合的试剂或试剂盒属于本专利技术的保护范围本专利技术提供了上述引物组合在检测水稻耐冷基因CTB4a中的应用。
[0013]所述的应用，进一步包括以下步骤：（1）提取待检测水稻材料基因组DNA：（2）以待测水稻基因组DNA为模板，利用引物组合ctb4a
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1930 F/ctb4a
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1930 R进行扩增；（3）用限制性内切酶HindⅢ对PCR扩增产物进行酶切，其结果有一下几种情况：若PCR产物在酶切后只显示1条条带，则待测水稻材料携带耐冷性单倍型CTB4a；若PCR产物在酶切后只显示2条条带，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a；若PCR产物在酶切后只显示3条条带，则待测水稻材料则同时携带有耐冷性单倍型CTB4a和非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。
[0014]步骤2中的PCR扩增反应条件为：预变性温度：95℃，时间：5min；变性温度：95℃，时间：30s；退火温度即TM值：56℃，时间：30s；延伸温度：72℃，时间：1min；保温：72℃，时间：5min。
[0015]PCR扩增体系如下：PCR反应体系为20μL，其中包含：2
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phanta max master mix10μL，10mmol/LCTB4a
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1930 F 1μL，10mmol/L CTB4a
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1930 R 1μL，基因组DNA模板(20ng) 1μL，ddH2O 7μL。
[0016]本专利技术提供了上述特异性分子标记在辅助鉴定水稻耐冷基因CTB4a中的应用。
[0017]本专利技术提供了上述特异性分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在水稻种质资源鉴定、筛选中的应用。
[0018]本专利技术提供了上述的特异性分子标记或引物组合或含有该引物组合的试剂盒在
耐冷能性水稻品种选育本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水稻耐冷基因CTB4a的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记位于CTB4a编码基因启动子区域的SNP
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1930处。2.根据权利要求1所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记的SNP位点碱基多态性为G/C；若该位点处碱基为G，则待测水稻材料具有耐冷性基因CTB4a，若该位点处碱基为C，则待测水稻材料则携带有CTB4a的非耐冷性基因单倍型类型ctb4a。3.根据权利要求1所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记的检测引物组合包括引物ctb4a
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1930F和ctb4a
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1930R，以及限制性内切酶HindⅢ。4.根据权利要求3所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记检测引物组合的PCR扩增反应条件为：预变性温度：95℃，时间：5min；变性温度：95℃，时间：30s；退火温度即TM值：56℃，时间：30s；延伸温度：72℃，时间：1min；保温：72℃，时间：5min。5.根据权利要求3所述的特异性分子标记，其特征在于，所述特异性分子标记检测引物组合的PCR扩增体系如下：PCR反应体系为20μL，其中包含：2
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phantamaxmastermix10μL，10mmol/LCTB4a
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1930F1μL，10mmol/LCTB4a
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1930R1μL，基因组DNA模板(20ng)1μL，ddH2O7μL。...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙一丁，汤翠凤，杨雅云，戴陆园，许明辉，马继琼，杨奕，董超，阿新祥，张斐斐，王斌，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：