甘蓝型油菜产量性状相关miRNA及其筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及植物基因工程技术和油菜的分子育种技术领域，具体涉及甘蓝型油菜产量性状相关miRNA及其筛选方法和应用。本发明专利技术从影响油菜产量三因素“源、流、库”的“流”的过程解析作物高产的新机理，将粒果比这个较为新颖的性状作为反映油菜产量的性状，筛选出了9个与甘蓝型油菜产量相关的miRNA，包括：bna

【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜产量性状相关miRNA及其筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及植物基因工程技术和油菜的分子育种
，具体涉及甘蓝型油菜产量性状相关miRNA及其筛选方法和应用。

技术介绍

[0002]作为世界上主要的三大油料作物之一，油菜是我国种植面积最大的油料作物。但是作为一种以收获籽粒为主的经济作物，相较于水稻和花生等具有50％以上收获指数的作物，油菜栽培品种的收获指数却只有20
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30％，因此提高油菜收获指数对提高其产量显得尤为重要。影响植物收获指数的因素主要有3个，即“源、流、库”。“源”是指植物中可以进行光合作用，产生并输出光合产物的组织器官，如植物的茎秆、叶片等。“库”是指植物中不能直接进行光合作用，用于转化或者储藏光合同化产物的组织器官，库器官在不同作物及同种作物不同发育时期均不同，比如植物生长发育过程中的根，果实及种子，也可能是正在生长发育的作物的根、茎、叶等。“流”是指光合产物从源器官转运到库组织的过程，流包括光合产物在源器官中的装载，库组织中的卸载及源、库之间的运输和分配。
[0003]油菜在不同生长发育时期具有不同的光合器官，苗期叶片是唯一的光合器官(营养生长时期)；抽薹之后茎秆除了支撑油菜生长和临时储藏物质之外，也承担了一部分的光合作用(营养生长向生殖生长转换的时期)；花期阶段，角果逐渐生长，叶片逐渐老化，角果皮逐渐替代了叶片的光合作用(生殖生长时期)。油菜产量形成的过程为：前期叶片、茎枝等营养器官进行光合作用，产生光合产物的量、分配及运输效率决定了油菜的角果数量；后期利用营养器官干物质的分配、转运以及角果皮光合产物转运至籽粒的强度，影响粒果比和收获指数，进一步形成高低产的油菜。研究表明，在影响收获指数的“源、流、库”三因素中，油菜有充足的源和库，因此，研究流
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即光合同化物的转运和分配成为提高油菜产量的突破口。前期研究也表明，多个与油菜产量相关的性状都是受微效多基因调控的数量性状，加之异源四倍体的甘蓝型油菜在进化过程中发生了全基因组三倍化事件，产生了较多冗余的同源基因，导致单基因大幅提高油菜产量的概率很低，寻找某种大范围调控油菜产量的功能因子是大幅提高油菜产量的关键所在。
[0004]miRNA是存在于真核细胞中的一种内源性的、由非编码蛋白基因转录生成的21
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25个核苷酸组成的单链RNA小分子(Bartel,2004)，主要分布在两个基因的间隔中，通过对靶基因mRNA的切割(Hammond et al.,2000)或者抑制其翻译过程(Chen,2005)完成对靶基因转录后表达水平的调控。miRNA的靶基因是对植物生长发育比较重要的调节因子或者是一些非常重要的转录因子，所以单个miRNA表达水平的变化便可能会导致成百上千个靶基因蛋白水平的差异(Baek et al.,2008)，因此miRNA在植物的整个生长发育周期内均发挥了至关重要的作用。尤其是植物体内的miRNA几乎参与了营养生长到生殖生长整个生长周期的调控网络，如植株营养生长阶段叶形态的建成(Bao et al.,2004)、营养生长向生殖生长阶段的转换(Aukerman et al.,2003；Dugas&Bartel,2004)、生殖生长阶段花器官的发育(Aukerman et al.,2003；Cartolano et al.,2007)和分枝的形成(Wang et al.,2010)、生
长期的逆境胁迫(Shukla et al.,2008；Sunkar et al.,2012)等。
[0005]因此，研究影响甘蓝型油菜产量性状相关的miRNA，对大幅提高油菜复杂产量性状具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过对588份群体材料连续三年的田间表型分析，发现粒果比性状能很好的反映植株光合产物的运转能力，进而反映油菜的产量；进一步地，本专利技术在群体材料中筛选了达到显著差异的两对粒果比性状极端材料(L1/L2；L3/L4)进行miRNA测序分析，共鉴定出1792个新的miRNA，其中，四个材料中共同重合鉴定到213个，结合甘蓝型油菜中92个已知的miRNA，最终在粒果比材料中共鉴定获得1884个miRNA，对这1884个miRNA进行靶基因预测，发现他们共调控下游13177个靶标基因的表达。
[0007]通过差异表达miRNA分析，发现两对极端材料中共鉴定出调控3405个靶基因的234个DEMs，其中22个是甘蓝型油菜中已知的miRNA，212个是粒果比极端材料中新鉴定出的miRNA。在L1/L2材料比较中，共鉴定出130个DEMs，L3/L4材料中共鉴定出143个DEMs，而两对材料中共同鉴定出39个重合的DEMs。对39个共同重合的DEMs进行靶基因的预测，发现他们介导605个靶基因的表达，进一步对靶基因进行KEGG富集分析，发现其中有13个参与植物糖代谢通路的靶基因，反向筛选发现共有9个miRNA负责介导这13个参与植物糖代谢通路的靶基因，其中两个是甘蓝型油菜中已知的bna
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miR159和bna
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miR166f，另外7个是分别定位在A03、A05、A09、A10、Ann和C03染色体上，其中的miR159与miR166均被证实过对柱头绒毡层的降解和花药中花粉的释放具有一定的调控作用，对植株花粉和花药的发育作用显著(Li et al.,2015)。为后期通过基因工程途径进行高产高收获指数油菜品种的选育奠定了理论基础。
[0008]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供甘蓝型油菜产量性状相关miRNA及其筛选方法和应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：
[0010]甘蓝型油菜产量性状相关miRNA，包括：bna
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miR166f、bna
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miR159、bna_novel_78、bna_novel_61、bna_novel_4、bna_novel_188、bna_novel_16、bna_novel_15、bna_novel_12，其中bna
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miR166f的成熟序列为UCGGACCAGGCUUCAUCCCCC，bna
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miR159的成熟序列为UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA，bna_novel_78的成熟序列为AAUUCCAAUGGGUAGAACCCC，bna_novel_61的成熟序列为GUGUUGAAUUCUGGUCUAGU，bna_novel_4的成熟序列为AAAGACUCUCGGAAGACUUCUUGA，bna_novel_188的成熟序列为CGAAUCUGUGUGCUAAAAGAAACC，bna_novel_16的成熟序列为UAAGCUGCCAGCAUGAUCUUG，bna_novel_15的成熟序列为AUCAACGUUGGCUCAAUUAUG，bna_novel_12的成熟序列为UAAAAAUGAUUUCUGCGAACGC。
[0011本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甘蓝型油菜产量性状相关miRNA，包括：bna
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miR166f、bna
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miR159、bna_novel_78、bna_novel_61、bna_novel_4、bna_novel_188、bna_novel_16、bna_novel_15、bna_novel_12，其中，bna
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miR166f的成熟序列为UCGGACCAGGCUUCAUCCCCC，bna
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miR159的成熟序列为UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA，bna_novel_78的成熟序列为AAUUCCAAUGGGUAGAACCCC，bna_novel_61的成熟序列为GUGUUGAAUUCUGGUCUAGU，bna_novel_4的成熟序列为AAAGACUCUCGGAAGACUUCUUGA，bna_novel_188的成熟序列为CGAAUCUGUGUGCUAAAAGAAACC，bna_novel_16的成熟序列为UAAGCUGCCAGCAUGAUCUUG，bna_novel_15的成熟序列为AUCAACGUUGGCUCAAUUAUG，bna_novel_12的成熟序列为UAAAAAUGAUUUCUGCGAACGC。2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜产量性状相关miRNA，其特征在于，bna
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miR166f介导的靶基因为BnaA10g29510D,bna
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miR159介导的靶基因为BnaA05g04000D、BnaC04g03750D、BnaA04g17070D、BnaC04g40390D，bna_novel_78介导的靶基因为BnaC02g25850D，bna_novel_61介导的靶基因为BnaA08g01250D，bna_novel_4介导的靶基因为BnaC03g67280D，bna_novel_188介导的靶基因为BnaA06g37210D、BnaC07g47450D，bna_novel_16介导的靶基因为BnaC02g08960D，bna_novel_15介导的靶基因为BnaA09g15720D，bna_novel_12介导的靶基因为BnaC09g40790D。3.权利要求1
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2任意一项所述的甘蓝型油菜产量性状相关miRNA在甘蓝型油菜育种中的应用。4.甘蓝型油菜产量性状相关miRNA的筛选方法，其特征在于，所述方法包括如下：在群体材料中筛选达到显著差异水平的两对粒果比性状极端材料，对选出来的极端材料花后15天和35天的籽粒和角果皮进行miRNA测序；利用Hiseq技术对miRNA测序的Rawdata进行处理，过滤掉低质量序列、polyA序列以及小片段序列等杂质获得clean tags，并保存为FASTQ格式进行后续的分析，数据过滤完成后，采用Bowtie软件将clean tags与已知的miRNA数据库进行比对分析，通过与已知的miRNA数据库比对筛选出甘蓝型油菜中已知的miRNA，利用RIPmiR软件预测出新的miRNA；使用在线预测网站http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/预测miRNA靶基因，其中，期望值最大设置为3；采用TPM对每个材料样品的miRNA表达量进行计算，其中,TMP计算公式为TPM＝C*1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张立源，曲存民，陈志友，陈思，杨博，张超，卢坤，李加纳，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：