高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体及其制备方法及其应用技术

本申请涉及抗体制备领域，具体公开了一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体及其制备方法及其应用。高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体包括抗钙调蛋白纳米抗体，所述抗钙调蛋白纳米抗体包括单域重链可变区，所述单域重链可变区包括包含特定氨基酸序列的CDR

【技术实现步骤摘要】
高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体及其制备方法及其应用


[0001]本申请涉及抗体制备领域，更具体地说，它涉及一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体及其制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]纳米抗体，或称单域重链抗体，仅包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，与普通抗体相比缺少轻链，且重链可变区与铰链区之间没有CH1区，相对分子质量小于15kDa，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。纳米抗体能够高特异性、高亲和力地与抗原结合，且组织穿透力强，稳定性高，在疾病的诊断及治疗方面有广阔的应用前景。
[0003]Calponin是一种结合原肌球蛋白和F
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肌动蛋白的钙调蛋白，是平滑肌细胞的一种特异性蛋白，具有调节平滑肌收缩的功能。Calponin是分化标志蛋白,在分化型平滑肌细胞中大量表达,它通过与细胞骨架蛋白肌动蛋白相结合,参与肌动蛋白细胞骨架重构,具有多种生物学功能,其表达改变与许多疾病的发生发展密切相关。
[0004]在临床上，需要使用Calponin免疫治疗药物的恶性实体瘤患者要预先接受肿瘤组织的免疫组化检测，以确定肿瘤组织是否表达Calponin分子，以及表达Calponin的细胞比例，从而更有针对性的使用抗Calponin药物，辅助医生和患者合理选择治疗方式，由于免疫组化检测样本的特殊性，对检测用抗体的穿透能力有很高的要求。目前，体外诊断钙调蛋白免疫组化检测用抗体多为鼠源单克隆抗体，然而，鼠源单克隆抗体的相对分子量在150kDa左右，体积较大，穿膜能力及组织渗透能力较弱，检测的灵敏性和准确性有所欠缺。
[0005]针对上述中的相关技术，专利技术人认为常用的鼠源单克隆抗体在用于钙调蛋白免疫组化检测时存在组织穿透性较差的缺点。

技术实现思路

[0006]为了提高体外诊断钙调蛋白免疫组化检测用抗体的组织穿透性，本申请提供一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体及其制备方法及其应用。
[0007]第一方面，本申请提供一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体，采用如下的技术方案：一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体，包括抗钙调蛋白纳米抗体，所述抗钙调蛋白纳米抗体包括单域重链可变区，所述单域重链可变区包括包含如下氨基酸序列的CDR
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L1，CDR
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L2和CDR
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L3：CDR
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L1：LIFEIYSSA，CDR
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L2：VKGR，CDR
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L3：ARNPTG。
[0008]优选的，所述单域重链可变区包括如下所示的氨基酸序列：QVQLQESGGGSGQVGTSLRLSCLIFEIYSSACMGWFRQAPGKEREWVHGSIVSFSDARTNYADAVKGRFTGTQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCARNPTGINKTRRYDYWGQGTQVTVSS。
[0009]通过采用上述技术方案，抗钙调蛋白纳米抗体特异性地与钙调蛋白结合，且分子量小，具有更高的组织穿透性，对样本具有很好的适应性，能够使胞内、组织内显像更加清
晰，准确，更加适用于钙调蛋白免疫组化检测；抗钙调蛋白纳米抗体的体内半衰期可控，在肿瘤治疗中，由于正常平滑肌细胞也低量表达Calponin，以肿瘤微环境控制凋亡肿瘤细胞抗体药物对半衰期的要求非常严格，因此半衰期可控的抗钙调蛋白纳米抗体能够更加适用于肿瘤的诊断；抗钙调蛋白纳米抗体与人体的同源性极高，且分子量小，使得对抗钙调蛋白纳米抗体进行少量的人源化便能够达到极低的排异性，有利于降低抗体药物人源化的难度。
[0010]优选的,所述高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体还包括与所述抗钙调蛋白纳米抗体串联的辣根过氧化物酶。
[0011]通过采用上述技术方案，将抗钙调蛋白抗体与HRP(辣根过氧化物酶)相串联，在免疫组化检测中可以直接将目标蛋白定位，减少了二抗孵化步骤，实现了一步免疫组化检测，有利于降低检测时间，能够减少二抗孵化步骤中引入非特异性结合的可能性，提高了检测结果的准确性。
[0012]第二方面，本申请提供一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体的制备方法，采用如下的技术方案：一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：制备重组钙调蛋白；采用重组钙调蛋白作为抗原免疫羊驼，利用免疫后羊驼的外周血淋巴细胞构建噬菌体文库；对所述噬菌体文库进行淘选，获得抗钙调蛋白纳米抗体。
[0013]通过采用上述技术方案，能够制得具有高特异性、高亲和力、高通透性的抗钙调蛋白纳米抗体。
[0014]优选的，所述制备重组钙调蛋白的方法包括以下步骤：获得钙调蛋白基因，将钙调蛋白基因克隆至重组载体上，转化宿主细胞，表达重组钙调蛋白，对重组钙调蛋白进行纯化。
[0015]优选的，采用镍柱亲和层析对重组钙调蛋白进行纯化。
[0016]优选的，采用重组钙调蛋白作为抗原免疫羊驼的方法包括：采用颈背部皮下多点注射的方式，将0.1
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0.5mg重组钙调蛋白注射入羊驼体内进行动物免疫，免疫用佐剂为角鲨烯佐剂；进行多次免疫注射，每次免疫的间隔为20
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30天。
[0017]优选的,所述构建噬菌体文库的步骤包括：提取免疫后羊驼的外周血淋巴细胞的RNA，反转录获得cDNA；以cDNA链为模板进行PCR扩增，获得抗钙调蛋白的重链可变区基因片段，将所述抗钙调蛋白的重链可变区基因片段连接入展示载体中，转化感受态细胞，构建纳米抗体文库；用噬菌体感染所述纳米抗体文库，获得噬菌体展示基因文库，采用噬菌体展示技术进行淘选，获得抗钙调蛋白纳米抗体。
[0018]优选的，所述PCR扩增为巢式PCR，包括以下步骤：以cDNA链为模板进行第一次PCR扩增；用第一次PCR扩增的产物进行2％琼脂凝胶电泳，回收600
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800bp的条带；以上述第一次PCR胶回收的产物为模板，进行第二次PCR扩增。
[0019]通过采用上述技术方案，提高了扩增特异性，有利于提高获得的抗钙调蛋白的重链可变区基因的特异性。
[0020]优选的，所述展示载体为pMES4载体，所述感受态细胞为TG1感受态细胞。
[0021]在一个具体的可实施方案中，所述制备方法还包括以下步骤：通过基因测序获得所述抗钙调蛋白抗体的单域重链可变区基因序列；获得辣根过氧化物酶基因序列；将所述抗钙调蛋白抗体的单域重链可变区基因序列与所述辣根过氧化物酶基因序列串联，克隆入表达载体中，构建重组表达载体，用所述重组表达载体转染宿主细胞，表达抗钙调蛋白融合纳米抗体，对抗钙调蛋白融合纳米抗体进行纯化。
[0022]优选的，所述表达载体为PCDNA3.1(+)载体，所述宿主细胞为HEK293细胞。
[0023]优选的，采用免疫亲和层析柱纯化抗钙调蛋白融合纳米抗体。
[0024]第三方面，本申请提供一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体的应用，采用如下的技术方案：一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体的应用，应用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体，其特征在于：包括抗钙调蛋白纳米抗体，所述抗钙调蛋白纳米抗体包括单域重链可变区，所述单域重链可变区包括包含如下氨基酸序列的CDR
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L1，CDR
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L2和CDR
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L3：CDR
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L1：LIFEIYSSA，CDR
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L2：VKGR，CDR
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L3：ARNPTG。2.根据权利要求1所述的高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体，其特征在于：所述单域重链可变区包括如下所示的氨基酸序列：QVQLQESGGGSGQVGTSLRLSCLIFEIYSSACMGWFRQAPGKEREWVHGSIVSFSDARTNYADAVKGRFTGTQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCARNPTGINKTRRYDYWGQGTQVTVSS。3.根据权利要求1所述的高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体，其特征在于：还包括与所述抗钙调蛋白纳米抗体串联的辣根过氧化物酶。4.一种如权利要求1
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3任一项所述的高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：制备重组钙调蛋白；采用重组钙调蛋白作为抗原免疫羊驼，利用免疫后羊驼的外周血淋巴细胞构建噬菌体文库；对所述噬菌体文库进行淘选，获得抗钙调蛋白纳米抗体。5.根据权利要求4所述的高通透性抗钙调蛋白融合纳米抗体的制备方法，其特征在于：采用重组钙调蛋白作为抗原免疫羊驼的方法包括：采用颈背部皮下多点注射的方式，将0.1
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0.5mg的重组钙调蛋白注射入羊驼体内进行动物免疫，免疫用佐剂为角鲨烯佐剂；进行多次免疫注射，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王升平，谭爱梅，罗帅，
申请(专利权)人：山东立菲生物产业有限公司，
类型：发明
国别省市：