CENP-B结合蛋白、其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了CENP

【技术实现步骤摘要】
CENP
‑
B结合蛋白、其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗体
，尤其是涉及一种CENP
‑
B结合蛋白、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]着丝粒蛋白B(CENP
‑
B)主要位于着丝粒的中心结构域，相对分子质量约80kD，是由不含内含子单一拷贝基因编码的2.9kb mRNA的产物，属于螺旋
‑
环
‑
螺旋家族的DNA结合蛋白，能特异地与α
‑
卫星DNA中高度重复的17bp核苷酸序列(称为CENP
‑
B盒)结合。
[0003]1980年首次发现局限性系统性硬化症(CREST综合症)患者血清可以和染色体上的着丝粒结合，免疫荧光显示出中期细胞成对的着丝粒斑点，说明CREST综合症病人血清中含有抗着丝粒蛋白的抗体(anti
‑
centromere autoantibody，ACA)。进行性系统性硬皮病(progressive systematic sclerosis，PSS)是常见的自身免疫性疾病，在患病人群体中有一类发生变异，临床主要表现为钙质沉着(calcinosis)，雷诺现象(Raynaud phenomenon)、食管运动失调(esophageal dysmobility)、趾指硬化病(sclerodactyly)、毛细血管扩张性变异(talangiactasia)等症状，这些症状的字头字母构成的“CREST”一词就是这种局限性系统性硬化症名称的由来。CREST综合症在PSS中属于症状较为轻缓、存活期较长的一个变异类型，对其早期诊断并与其他类型进行区分具有重要的临床应用价值。近年来，很多文献报道ACAs可见于多种疾病，除系统性硬化症、干燥综合症(SS)、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)外，还多见于重叠综合症、原发性胆汁肝硬化、重症肌无力、Parrg
‑
Romberg综合症(帕
‑
罗综合征)、Grave病(毒性弥漫性甲状腺肿)、Buerger
’
s病(血栓闭塞性动脉炎)、白癜风以及不明原因的肝硬化、硬化性胆管炎等。对ACA阳性患者早期发现、长期随诊、警惕肝、肺损害并及早给予治疗是非常重要的。ACA识别的着丝粒蛋白(centromere proteins，CENPs)主要有CENP
‑
A、CENP
‑
B和CENP
‑
C等，而其中CENP
‑
B能被大多数的ACA识别，这为建立一种快速的临床诊断方法提供了重要的理论依据。
[0004]抗着丝粒抗体是CREST综合症的特异性抗体，阳性率可达50％～80％；同时也见于SLE、RA和SS等结缔组织病，但阳性率小于5％。因此制备出高亲和力的抗CENP
‑
B重组单抗对开发诊断试剂盒具有着重要意义和价值。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供能够特异结合CENP
‑
B、具有良好的结合能力的CENP
‑
B结合蛋白。基于本专利技术提供的CENP
‑
B结合蛋白，本专利技术的目的还在于提供其应用。
[0007]名词定义：
[0008]在本专利技术中“结合蛋白”此技术术语是指结合特定抗原的蛋白，其泛指包含互补决定区(CDR区)的一切蛋白及蛋白片段。蛋白及蛋白片段可以为抗体，“抗体”和“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体。抗体的类型可能为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合
型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。蛋白及蛋白片段也可以是包含抗体CDR的一部分或全部的抗原结合片段，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自但不限于F(ab
’
)2、Fab
’
、Fab、Fv(由VH和VL构成)，ScFv(单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成)、单域抗体(仅由VH组成)、dsFv(二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragments,dsFv))、双特异抗体、纳米抗体和抗体最小识别单位中的任意一种。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
[0009]CENP
‑
B结合蛋白的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的骨架区构成。骨架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》((Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等)和Chothia中。抗体的骨架区，即构成要件轻链和重链的组合的骨架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
[0010]当在本文中使用时，“骨架区”或“FR”区意味着可变结构域中排除被定义为CDR区域之外的区域。每个可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1
‑
CDR1
‑
FR2
‑
CDR2
‑
FR3
‑
CDR3
‑
FR4。
[0011]本专利技术不限制CENP
‑
B结合蛋白的获得方式。在一些可选的实施方式中，细胞携带所述多核苷酸、含有所述载体或能够表达CENP
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B结合蛋白。利用编码CENP
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B结合蛋白的多核苷酸与载体连接后，在细胞表达能够获得相应CENP
‑
B结合蛋白。可以将上述载体导入到真核细胞、尤其是哺乳动物细胞中，构建获得能够表达所述CENP
‑
B结合蛋白的细胞。在另一些可选的实施方式中，CENP
‑
B结合蛋白还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过肽合成，如自动肽合成仪获得(例如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪)；当CENP
‑
B结合蛋白为抗原结合片段时，还可选地通过抗原结合分子(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.CENP
‑
B结合蛋白，其特征在于，具有重链可变区和/或轻链可变区；所述重链可变区包括互补决定区VH
‑
CDR1、VH
‑
CDR2和VH
‑
CDR3；所述轻链可变区包括互补决定区VL
‑
CDR1、VL
‑
CDR2和VL
‑
CDR3；所述VH
‑
CDR1的氨基酸序列为A
‑
X1
‑
T
‑
F
‑
T
‑
S
‑
X2
‑
P，其中X1为F或W，X2为Y或S，如SEQ ID NO:1～4所示；所述VH
‑
CDR2的氨基酸序列为I
‑
X3
‑
E
‑
G
‑
X4
‑
V
‑
D
‑
T，其中X3为S或Y，X4为G或A，如SEQ ID NO:5～8所示；所述VH
‑
CDR3的氨基酸序列为A
‑
X5
‑
G
‑
L
‑
K
‑
G
‑
X6
‑
A
‑
Y，其中X5为R或K，X6为F或W，如SEQ ID NO:9～12所示；所述VL
‑
CDR1的氨基酸序列为E
‑
N
‑
I
‑
X7
‑
T
‑
N，其中X7为Y或S，如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示；所述VL
‑
CDR2的氨基酸序列为G
‑
X8
‑
T，其中X8为A，氨基酸序列为GAT；或X8为G，氨基酸序列为GGT；所述VL
‑
CDR3的氨基酸序列为Q
‑
H
‑
F
‑
X9
‑
T
‑
I
‑
P
‑
X10
‑
T，其中X9为W或F，X10为Y或S，如SEQ ID NO:17～20所示。2.根据权利要求1所述的CENP
‑
B结合蛋白，其特征在于，所述CENP
‑
B结合蛋白与CENP
‑
B具有Kd≤5.6
×
10
‑8mol/L的亲和力。3.根据权利要求1所述的CENP
‑
B结合蛋白，其特征在于，所述CENP
‑
B结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区中各互补决定区的突变位点选自下述突变组合1～32中的任意一种：
优选地，各互补决定区的突变位点选自突变组合1、2、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、21、22、30、31或32；优选地，各互补决定区的突变位点选自突变组合1或16。4.根据权利要求3所述的CENP
‑
B结合蛋白，其特征在于，所述CENP
‑
B结合蛋白还包括骨架区；优选地，所述重链可变区还包括骨架区VH
‑
FR1、VH
‑
FR2、VH
‑
FR3和VH
‑
FR4；所述轻链可变区还包括骨架区VL
‑
FR1、VL
‑
FR2、VL
‑
FR3和V...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘一楠，叶悦云，曾敏霞，
申请(专利权)人：珠海丽禾医疗诊断产品有限公司，
类型：发明
国别省市：