Rab8蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种用Rab8蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。本发明专利技术依靠骆驼科动物的免疫系统筛选、鉴定并制备特异性识别、结合Rab8蛋白的抗体，所得到的抗体特异性强，可用于目标抗原检测，有潜在临床诊断和治疗价值；且本发明专利技术提供的抗体结构简单，容易进行基因工程改造，也容易实现人源化，稳定性高，量产成本低，有利于实现规模化生产。产。

【技术实现步骤摘要】
Rab8蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及Rab8蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]抗体是一种主要由浆细胞分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等外来物的蛋白质，该外来物被称为抗原。抗体和抗原的结合完全依靠非共价键的相互作用，这种特异性的结合机制使得抗体可以捕获外来微生物以及受感染的细胞，进一步诱导其他免疫机制对其进行攻击，或直接中和其目标。抗体及抗体相关产品已经被广泛应用于生命科学与医学等研究领域，基于抗原
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抗体特异性结合而衍生的诸多实验技术奠定了科学研究与临床治疗的重要基础，例如免疫诊断、免疫印迹、酶联免疫吸附、流式细胞分析等等。
[0003]Rab8(Ras
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related protein 8)是Ras超家族的成员，在蛋白质转运和膜重组中发挥作用。Rab家族蛋白质在非活性GDP结合形式和活性GTP结合形式之间循环，能够将不同组的下游效应子募集到膜上，直接负责囊泡的形成、运动、束缚和融合。Rab8的细胞生理功能包括参与极化囊泡运输和神经递质释放、与多种重要蛋白质共同促进转胞吞作用、调节高尔基体的紧凑形态、参与上皮细胞极化、参与膜运输到纤毛和纤毛发生、调节粘附连接组件等。
[0004]在研究Rab8过程中，抗体是一个非常重要的研究工具，对于患者诊断、病毒分析与研究等都具有重大的价值和意义。然而，传统的鼠、兔等动物仅能识别抗原表面平展的多肽。因此，需要开发一种能够识别抗原表面复杂的空间结构，产生高度特异性、高亲和力的纳米抗体。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本专利技术提供了一种Rab8蛋白的特异性抗体及其制备方法与应用。
[0006]第一方面，本专利技术提供用Rab8蛋白免疫骆驼科动物所得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
[0007]在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。
[0008]在一些实施方案中，所述抗体为纳米抗体，所述抗体活性片段为纳米抗体活性片段。
[0009]在一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体。
[0010]在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段与所述Rab8蛋白结合的kd值在500nM以下，优选在200nM以下，更优选在100nM以下。
[0011]在一些实施方案中，所述Rab8蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。进一步
优选地，所述Rab8蛋白由包括如下步骤的方法制备而成：将编码所述Rab8蛋白的核苷酸序列构建至载体质粒；将所述载体质粒转染至真核细胞系中表达，纯化。
[0012]在一些实施方案中，所述Rab8蛋白可通过商业渠道获得。
[0013]第二方面，本专利技术提供一种构建抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：
[0014](1)将Rab8蛋白作为抗原免疫骆驼科动物，采集被免疫动物的静脉外周血，分离得到淋巴细胞；
[0015](2)提取所述淋巴细胞的总mRNA，反转录为cDNA并进行扩增；
[0016](3)将所述扩增得到的DNA插入病毒表达载体，转化入细菌，收集菌落，得抗体文库。
[0017]在一些实施方案中，所述骆驼科动物选自单峰驼、双峰驼、美洲驼、骆马、羊驼和小羊驼，优选为羊驼。
[0018]在一些实施方案中，步骤(1)所述免疫采用皮下注射方式。所述免疫的次数优选为3～5次。所述静脉外周血优选在最后一次免疫之前和之后分别采集。
[0019]在一些实施方案中，步骤(3)所述病毒表达载体为噬菌体表达载体。
[0020]在一些实施方案中，步骤(3)所述细菌为TG1感受态细菌。
[0021]第三方面，本专利技术提供上述构建抗体文库的方法获得的抗体文库，或由所述抗体文库表达产生的多克隆抗体。
[0022]第四方面，本专利技术提供一种构建抗原特异性抗体文库的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得抗原特异性抗体文库。
[0023]在一些实施方案中，所述构建抗原特异性抗体文库的方法包括如下步骤：
[0024](i)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；
[0025](ii)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；
[0026](iii)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，收集菌落，获得抗原特异性抗体文库。
[0027]在一些实施方案中，步骤(iii)所述细菌为大肠杆菌。
[0028]第五方面，本专利技术提供上述构建抗原特异性抗体文库的方法获得的抗原特异性抗体文库，或由所述抗原特异性抗体文库表达产生的与抗原特异性结合的多克隆抗体。
[0029]第六方面，本专利技术提供一种制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法，所述方法包括如下步骤：对第三方面所述的抗体文库进行筛选，获得与抗原特异性结合的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
[0030]在一些实施方案中，所述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法包括如下步骤：
[0031](a)对所述抗体文库进行培养，释放病毒；
[0032](b)将所述病毒与抗原进行孵育，去掉与抗原非特异性结合的病毒，保留与抗原特异性结合的病毒；
[0033](c)用所述与抗原特异性结合的病毒侵染细菌，将被侵染的细菌涂抹至平板培养基培养，挑选单一菌落。
[0034]在一些实施方案中，步骤(c)所述细菌为大肠杆菌。
[0035]在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，之后进行抗原特异性结合鉴定。
[0036]在一些实施方案中，可以对所述单一菌落进行扩大培养，然后进行步骤(d)：提取DNA，转化至宿主细胞并表达，以获得单克隆抗体。
[0037]第七方面，本专利技术提供采用上述制备抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段的方法获得的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段。
[0038]第八方面，本专利技术提供特异性识别和/或结合Rab8蛋白的抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段；所述抗原结合蛋白、抗体或抗体活性片段包含至少一个重链可变区；所述重链可变区具有：
[0039]如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的CDR1；
[0040]如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示的CDR2；和
[0041]如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的CDR3。
[0042]在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2和如SEQ ID NO:6所示的CDR3。
[0043]在一些实施方案中，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2和如SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.特异性识别和/或结合Rab8蛋白的纳米抗体或其活性片段。2.根据权利要求1所述的纳米抗体或其活性片段，其特征在于，所述纳米抗体或其活性片段包含重链可变区，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:4所示的CDR2和如SEQ ID NO:6所示的CDR3；或，如SEQ ID NO:3所示的CDR1、如SEQ ID NO:5所示的CDR2和如SEQ ID NO:7所示的CDR3；优选地，所述重链可变区具有：如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；或，如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。3.核酸分子，其编码权利要求1或2所述纳米抗体或其活性片段。4.表达载体，其含有权利要求3所述核酸分子；优选地，所述表达载体为噬菌体表达载体，优选为噬菌体表面展示筛选载体；更优选地，所述表达载体中还含有编码噬菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘剑峰，张胜蓝，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：