一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用，属于微生态活菌检测及鉴定技术领域。具体包括分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1~24所示；能够同时鉴定微生态四联活菌制品中的4种微生物的种属关系，操作简单，耗时短，鉴定范围广，无需对样品中的细菌进行培养，能够直接对样品进行鉴定，快速省时，成本低，灵敏度高，有利于产品的快速检验。产品的快速检验。产品的快速检验。

【技术实现步骤摘要】
一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于微生态活菌检测及鉴定
，具体涉及一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]微生态活菌制品中菌种是药品研究、生产和检定的物质基础，其质量直接与产品的安全和有效性密切相关。现行对菌种的质量控制标准主要包括形态观察、培养特性、产酸活性和安全性等传统方法，缺乏菌株分子生物学特征方面的评价和检测方法，尤其对于多联的微生态活菌制品（药物中含有2种以上的微生态活菌菌株），更无法实现实时快速检测。
[0003]双歧杆菌四联活菌片的主要成分是蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌，用于治疗与肠道菌群失调相关的腹泻、便秘、功能性消化不良。基于药品生产用菌种的菌株溯源、制剂工艺优化以及检定等方面考虑，加强药品生产用菌种的质量控制，明确产品中菌株的分子特征和遗传背景，建立一种快速的分子生物学检验方法，同时检测、鉴定四种活菌，将会极大的提升产品的质量保证水平和检验效率。
[0004]目前对于单个菌株的检测序列、引物有部分文献记载。检测方法主要包括常规PCR检测、多重PCR检测、实时荧光定量PCR检测、微滴数字PCR检测、环介导等温扩增检测等。这些方法均存在一些不足及缺陷，如精确性低、特异性差、引物交叉反应、假阳性率高、缺乏实时检测微生物的能力、存在漏检和误检等。针对四联活菌的微生物检测鉴定方法在单菌检测基础上，难度更高，现有方法缺陷集中体现在无法单次完成、扩增效率低下、假阳性率过高等，严重影响了多联活菌制剂中微生物的鉴定效率和结果的准确性。
[0005]目前常见的用于四联活菌制剂中微生物检测的引物序列包括：蜡样芽胞杆菌：bceT、entFM、hblA、hblC、hblD、cytK、hblA、nheA、nheB、nheC、ces、16S rRNA、gyrB等；粪肠球菌：gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yqiL；嗜酸乳杆菌：pheS、groEL、ileS、recA、recG、murC、murE；婴儿双歧杆菌：clpC、fusA、gyrB、ileS、purF、rplB、rpoB。
[0006]上述序列、引物可用于单菌株的测序，但是，不能混合使用，对双歧杆菌四联活菌制品中的四种微生态活菌同时展开检测，引物之间相互干扰严重。

技术实现思路

[0007]针对现有技术检测四联活菌制剂多条引物序列在同一反应体系中干扰严重的问题，本专利技术提供了一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合、试剂盒及应用，实现多条引物、多个序列在同一反应体系中的互不干扰，同时检测微生态四联活菌制品中的4种微生物，简单、快速、准确，有利于产品的快速检验。
[0008]本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合，包括分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌
的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组；所述的针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因的上游引物glpF
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物glpF
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针glpF
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述的针对蜡样芽孢杆菌的gmk基因的上游引物gmk
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物gmk
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针gmk
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；所述的针对粪肠球菌的gdh基因的上游引物gdh
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，下游引物gdh
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针gdh
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；所述的针对粪肠球菌的gyd基因的上游引物gyd
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物gyd
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针gyd
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所述的针对嗜酸乳杆菌的pheS基因的上游引物pheS
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物pheS
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，探针pheS
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所述的针对嗜酸乳杆菌的ileS基因的上游引物ileS
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物ileS
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针ileS
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所述的针对婴儿双歧杆菌的clpC基因的上游引物clpC
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示，下游引物clpC
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，探针clpC
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示；所述的针对婴儿双歧杆菌的fusA基因的上游引物fusA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示，下游引物fusA
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，探针fusA
‑
probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示。
[0009]一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒，包括上述引物探针组合。
[0010]优选地，所述探针的核苷酸序列5
’
端包括荧光报告基团，3
’
端包括荧光猝灭基团。
[0011]优选地，不同微生物对应的探针上标记不同的荧光报告基团。
[0012]优选地，所述的试剂盒中还包括阳性对照、阴性对照以及专属性对照，所述阳性对照为含有蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌和婴儿双歧杆菌4种菌株的混合菌体样品；所述阴性对照为DEPC水，所述专属性对照为同法测定的大肠埃希菌菌液。
[0013]进一步地，上述引物探针组合或上述试剂盒可应用于下列应用中的一种：a）鉴定蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌或婴儿双歧杆菌中的至少一种菌株；b）对蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌或婴儿双歧杆菌至少一种菌株的进行单端Sanger测序。
[0014]优选地，所述的检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合或检测微生态四联活菌制品中4种活菌的试剂盒对微生态四联活菌制品中4种活菌进行同时鉴定。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测微生态四联活菌制品中4种活菌的引物探针组合，其特征在于，包括分别针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因和/或gmk基因，针对粪肠球菌的gdh基因和/或gyd基因，针对嗜酸乳杆菌的pheS基因和/或ileS基因，针对婴儿双歧杆菌的clpC基因和/或fusA基因的引物探针组；所述的针对蜡样芽孢杆菌的glpF基因的上游引物glpF
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物glpF
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针glpF
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示；所述的针对蜡样芽孢杆菌的gmk基因的上游引物gmk
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，下游引物gmk
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，探针gmk
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；所述的针对粪肠球菌的gdh基因的上游引物gdh
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，下游引物gdh
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，探针gdh
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；所述的针对粪肠球菌的gyd基因的上游引物gyd
‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示，下游引物gyd
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，探针gyd
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所述的针对嗜酸乳杆菌的pheS基因的上游引物pheS
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示，下游引物pheS
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，探针pheS
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示；所述的针对嗜酸乳杆菌的ileS基因的上游引物ileS
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示，下游引物ileS
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，探针ileS
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probe的核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；所述的针对婴儿双歧杆菌的clpC基因的上游引物clpC
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示，下游引物clpC
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁勃，邢晟，冯丹阳，沈振，郭君贞，胡文红，李颖，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：