溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标及其检测方法技术

本发明专利技术公开了溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标及其检测方法，所述溶藻弧菌的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述河流弧菌的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。本发明专利技术不单公开了用于鉴别溶藻弧菌的一个特异性分子靶标和用于鉴别河流弧菌的四个特异性分子靶标，还提供了相关的特异性引物序列，以及相对应的PCR检测方法。本发明专利技术无需经过生理生化鉴别，具有检测时间短、成本低、特异性强等优点。强等优点。强等优点。

【技术实现步骤摘要】
溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标及其检测方法


[0001]本专利技术涉及细菌检测技术，具体地说，涉及溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标及其检测方法。

技术介绍

[0002]溶藻弧菌是革兰氏阴性菌，呈“逗号”或球状体。它是从副溶血弧菌中分离发现并与1968年正式命名为溶藻弧菌。它是一种嗜盐菌，不能在CLED琼脂上生长，但会在含有10%氯化钠的情况下生长。它在TCBS上形成大的黄色（蔗糖发酵）菌落。在非选择性固体培养基上存在明显的蜂群。这种生物广泛分布在海水和海鲜中，大部分感染都与接触海水或者海产品有关。在海水中发现的溶藻弧菌主要与胃肠炎、中耳炎和外耳道炎有关，但溶藻弧菌通常不具有创伤弧菌的毒力潜力，临床特征包括严重的皮肤感染和脓液。溶藻弧菌是海水养殖业中必须密切监测和控制的重要病原体，因为它具有强致病性、感染后迅速发病和水生动物高死亡率等特点，因此需要快速、简单、特异的方法进行现场检测，以有效控制疫情，防止经济损失。
[0003]河流弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性细菌。它具有笔直至略微弯曲的杆细胞形态，可通过极性鞭毛进行活动。河流弧菌被认为是食源性致病菌之一，与腹泻爆发和散发病例有关。该菌是在1975年从一名腹泻患者中首次分离发现，后被命名为河流弧菌。这种菌自然地分布于温暖、含盐的海水、河水中，可以在9℃至31℃的温度下存活，当水温升至18℃以上时会进行繁殖。河流弧菌的感染表现为季节性，大多数疾病的出现都是在具有最适温度和盐度的情况下发生的。它会导致霍乱样腹泻、皮肤感染（临床症状类似于长期处于水生环境下的皮肤感染）以及免疫低下的个体会发生败血症。在卫生条件较差的发展中国家，河流弧菌是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，不仅会危害人体健康而且也会导致淡水和海洋环境的损害。因此，我们想要预防由河流弧菌引起的新疾病，就必须要建立起有效的监测系统来提供感染的早期预警。
[0004]目前，对于溶藻弧菌和河流弧菌的检测，常常采用的是传统平板培养法。虽然平板检测具有成本低、特异性强等优点，但同时也有一些缺点，例如培养时间长、对操作人员和操作过程要求较为严格等。为了弥补平板检测法的不足，基于核酸扩增的分子学检测方法已经应用于食品中溶藻弧菌和河流弧菌的检测中。
[0005]基于核酸扩增的分子学检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择。目前，PCR检测方法是最常用的分子学检测方法之一，其引物是根据目标细菌基因组DNA特异性保守序列（检测靶点）进行设计的，因此检测靶点与引物，对于PCR检测的准确性和敏感程度来说是至关重要的。针对溶藻弧菌来说，该菌和副溶血弧菌等一起构成了弧菌属中的核心菌群
‑
哈维群弧菌，这些弧菌在表型和遗传型上面都十分相似，在检测过程中，也容易出现交叉；此外，河流弧菌常把toxR基因作为PCR靶基因，但在检测过程中，常常会受到副溶血弧菌的干扰，导致假阳性存在。因此为了将这些弧菌分离鉴定，迫切需要系统的、全面的挖掘特异性检测新标靶，从而提高溶藻弧菌和河流弧菌基于核酸扩增检测技术的准
确性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，采用泛基因组学技术，对溶藻弧菌和河流弧菌的核心基因和附属基因进行了全面分析，进而对核心基因部分进行BLAST分析，进一步锁定核心基因中的特异性基因区域，从而提供一种溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标及其检测方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标，所述溶藻弧菌的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述河流弧菌的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。
[0008]本专利技术还公开了一组检测上述特异性分子靶标的引物，其特征在于，特异性分子靶标SEQ ID NO.1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6，下游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；检测特异性分子靶标SEQ ID NO.2的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.8，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；检测特异性分子靶标SEQ ID NO.3的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.10，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；检测特异性分子靶标SEQ ID NO.4的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.12，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；检测特异性分子靶标SEQ ID NO.5的上游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.14，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
[0009]本专利技术还公开了上述分子靶标在制备检测创伤弧菌试剂中的应用。
[0010]本专利技术还公开了一种检测溶藻弧菌和河流弧菌的试剂盒，包括如上述的全部核苷酸序列。
[0011]本专利技术还公开了一种非疾病诊断治疗目的的检测溶藻弧菌和河流弧菌的方法，包括以下步骤：（1）提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，采用上述的引物对其进行PCR扩增；（2）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，电泳结果出现目标大小的条带（155 bp），则判定样品中含有溶藻弧菌，若电泳结果未出现目标大小的条带（155 bp）则判定样品中不含有溶藻弧菌；电泳结果出现目标大小的条带（145 bp， 130 bp，286 bp或282 bp），则判定样品中含有河流弧菌，若电泳结果未出现目标大小的条带（145 bp， 130 bp，286 bp或282 bp）则判定样品中不含有河流弧菌。
[0012]作为优选的，在上述的检测溶藻弧菌和河流弧菌的方法中，所述PCR扩增的反应体系为20微升，其中包括10
ꢀµ
L 2
×ꢀ
PCR Mix，2
µ
L模板DNA，10
µ
M的上下游引物。
[0013]作为优选的，在上述的检测溶藻弧菌和河流弧菌的方法中，所述PCR扩增的反应条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30s，共计35轮循环，72℃延伸5 min，4℃保持。
24189；泳道11铜绿假单胞杆菌ATCC 15442；泳道12铜绿假单胞杆菌ATCC 27853；泳道13阪崎克罗诺杆菌；泳道14肠炎沙门氏菌；泳道15鼠伤寒沙门氏菌；泳道N：阴性对照。
[0022]图9为具体实施方式中河流弧菌VF3引物对特异性结果；注：泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1为副溶血弧菌；泳道2为溶藻弧菌；泳道3为创伤弧菌；泳道4为河流弧菌；泳道5为蜡样芽胞杆菌；泳道6为大肠杆菌CICC 10411；泳道7为大肠杆菌CICC 10412；泳道8为大肠杆菌CICC 10662；泳道9为大肠杆菌CICC 10667；泳道10为大肠杆菌CICC 24189；泳道11为铜绿假单胞杆菌ATCC 15442；泳道12为铜绿假单胞杆菌ATCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测溶藻弧菌和河流弧菌的特异性分子靶标，其特征在于所述溶藻弧菌的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.1；所述河流弧菌的特异性分子靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5。2.一组检测如权利要求1所述的特异性分子靶标的引物，其特征在于，特异性分子靶标SEQ ID NO.1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6，下游引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.10，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.4的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.12，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；特异性分子靶标SEQ ID NO.5的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。3.权利要求1所述的分子靶标在制备检测溶藻弧菌和河流弧菌试剂中的应用。4.一种检测溶藻弧菌和河流弧菌的试剂盒，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶蕾，吕新瑞，徐洁茹，张依琳，张璜，石磊，白卫滨，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：