一种区分抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的装置及方法制造方法及图纸

本发明专利技术属于生物工程技术领域，具体涉及一种区分抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的装置及方法。本发明专利技术装置包括纳米孔、分子探针、肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元、纳米孔电生理信号检测单元；所述分子探针为探针A和探针B；所述纳米孔电生理信号检测单元含有HEPES、KCl、双层脂质膜或高分子膜、DPHPC。DPHPC。DPHPC。

【技术实现步骤摘要】
一种区分抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的装置及方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种区分抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的装置及方法。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯氏菌是临床感染中最严重的机会性病原体之一，通常存在于人和动物的肠道中，可引起包括中枢神经系统感染或腹腔感染等在内的严重的临床后果。目前使用抗菌药物是治疗肺炎克雷伯菌感染的方法。然而，广谱抗菌药物的广泛使用导致了日益严重的细菌耐药，进而导致临床治疗的延长和失败。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)是一类特殊的肺炎克雷伯菌，其特别对耐碳霉烯类抗生素耐药，而碳青霉烯类抗生素曾被称为“人类抵抗细菌的最后一道防线”。因此，能治疗一般的耐药肺炎克雷伯菌的广谱抗生素不一定能对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌有效果。文献资料《碳青霉烯类药物临床应用精要》公开了耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌可以通过β
‑
内酰胺酶的生成、孔蛋白的改变和外排泵活性的增加导致碳青霉烯耐药。
[0003]基于此，准确、快速地区分患者感染的细菌种类对于帮助选择抗菌药物进行后续治疗非常重要，因为明确细菌的耐药类型后可以帮助医生选择适当种类的抗菌药物，避免抗生素滥用，缩短治疗周期，改善预后。目前，细菌耐药性表型检测、β
‑
内酰胺酶检测和耐药性基因检测是用于耐药性检测的主要方法手段。但是，细菌耐药表型的检测需要较长的时间来培养肺炎克雷伯菌，因此通常是耗时的；β
‑
内酰胺酶检测虽然速度快，但检测范围相对较小，仅能检测很窄的浓度区间；而耐药性的基因检测虽然具有高精度，但是非常昂贵且耗时。
[0004]综上所述，需要提出一种更优化、高效的区分细菌是否耐药的装置及方法。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种区分抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的装置及方法，具体技术方案如下。
[0006]一种区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌(CSKP)的装置，所述装置包括纳米孔、分子探针、肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元、纳米孔电生理信号检测单元；所述分子探针为探针A和探针B，所述探针A和探针B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述纳米孔电生理信号检测单元含有HEPES、KCl、双层脂质膜或高分子膜、DPHPC。
[0007]进一步，所述纳米孔的直径范围为1.0
‑
1.5nm。
[0008]进一步，所述纳米孔的直径为1.3nm。
[0009]进一步，所述纳米孔的种类包括耻垢分枝杆菌孔蛋白A、alpha溶血素、氮化硅或石墨烯纳米孔。
[0010]进一步，所述肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元含有TRIZOL、乙醇、DEPC水/无RNase
水,和RNase抑制剂。
[0011]利用上述装置区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌的方法，包括以下步骤：
[0012]步骤1：在所述装置的肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元中，用TRIZOL提取肺炎克雷伯菌的总RNA，再用乙醇洗涤，加入DEPC水或无RNase水溶解后再加入RNase抑制剂进行储存；
[0013]步骤2：将所述装置的探针A和探针B与步骤1储存的样品通过退火形成16S rRNA
‑
探针复合物；
[0014]步骤3：将所述装置的纳米孔和步骤2的16S rRNA
‑
探针复合物置于所述装置的纳米孔电生理信号检测单元，对16S rRNA
‑
探针复合物通过纳米孔的电生理信号进行检测；
[0015]步骤4：对检测到的电生理信号进行分析以区分出耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌。
[0016]进一步，步骤3中进行电生理信号检测的电压条件为150毫伏。
[0017]进一步，所述装置的纳米孔插入所述装置的双层脂质膜或高分子膜中。
[0018]进一步，步骤4中分析纳米孔内的转运信号，选择阻塞率0.6至0.8，滞留时间100毫秒至400毫秒范围的转运信号作为特异性信号。
[0019]进一步，使用f＝0.1
·
min
‑1作为目标信号转运频率阈值来区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌。
[0020]有益技术效果
[0021]本专利技术提供了一种基于纳米孔的新颖，高效和快速的区分耐药肺炎克雷伯菌的装置和方法，实现了在单一分子水平上区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌。由于16S rRNA的种属鉴定是微生物组研究中常用的方法，具有种属特异性，因此本专利技术所提供的检测方案还可以适用于其他细菌的鉴定，再结合含抗生素环境/无抗生素环境的对照培养实验以及特定的电信号识别，即可实现对多种类耐药细菌的区分和鉴定。
[0022]本专利技术提供的检测方法与常规的纸片扩散方法和PCR法相比，具有高灵敏度，实时操作、低成本和耗时少的优势，经验证细菌培养时间仅需4小时，准确度为90％。
[0023]本专利技术提供的装置包含了区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌的整套必要试剂和特异性探针，操作方便，检测结果准确度高。因此在临床快速检测方面具有巨大的应用价值。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0025]图1为纳米孔的结构和纳米孔测定的单通道记录设置示例(a为MspA纳米孔结构示意图，b为MspA纳米孔待测信号转运示意图)；
[0026]图2为由探针A和探针B形成的16S rRNA
‑
探针复合物及其纳米孔电信号(a为探针A
和探针B形成16S rRNA
‑
探针复合物示意图；b为16S rRNA
‑
探针复合物琼脂糖电泳结果图；c为16S rRNA
‑
探针复合物的转运信号的滞留时间和峰值；d为单链DNA转运信号滞留时间和峰值)；
[0027]图3为探针组的易位电信号；
[0028]图4为区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌及单通道记录信号(a为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌组的易位频率，b为两种肺炎克雷伯菌的总RNA与探针A、B一起孵育后分别通过MspA纳米孔检测，c为纳米孔测到的信号的阻塞率和滞留时间绘制成的散点图)；
[0029]图5为临床样品的双盲测试和测定准确度的评估示例(a为两种肺炎克雷伯菌检测的目标信号转运频率阈值，b为检测样本的结果正确性统计图)；
[0030]图6为检测流程图和总时间成本示例；
[0031]图7为纳米孔检测碳青霉烯抗性肺炎克雷伯氏菌的方案流程示例。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌的装置，其特征在于，所述装置包括纳米孔、分子探针、肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元、纳米孔电生理信号检测单元；所述分子探针为探针A和探针B，所述探针A和探针B的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述纳米孔电生理信号检测单元含有HEPES、KCl、双层脂质膜或高分子膜、DPHPC。2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述纳米孔的直径范围为1.0
‑
1.5nm。3.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述纳米孔的直径为1.3nm。4.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述纳米孔的种类包括耻垢分枝杆菌孔蛋白A、alpha溶血素、氮化硅或石墨烯纳米孔。5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元含有TRIZOL、乙醇、DEPC水/无RNase水,和RNase抑制剂。6.利用权利要求1
‑
5任一项所述的装置区分耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌和碳青霉烯敏感类肺炎克雷伯菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：在所述装置的肺炎克雷伯菌RNA提取试剂单元中，用TRIZOL提取肺炎克雷伯菌的总RNA，再...

【专利技术属性】
技术研发人员：耿佳，魏于全，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：