一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的菌株及其应用，属于微生物技术领域。所述耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78(Escherichia coli K78)于2022年12月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.63055。大肠杆菌K78是以大肠杆菌K2为出发菌株，进行紫外线诱变和ARTP诱变后，再经筛选获得。该菌株在中性和酸性条件下聚唾液酸产量分别达到了1.736g/L和1.578g/L；在酸性培养基发酵罐中，聚唾液酸产量可达到6.86g/L，大肠杆菌K78稳定工业化生产PSA，有利于降低聚唾液酸的生产成本，对聚唾液酸的高效、绿色生产具有显而易见的有益效果。产具有显而易见的有益效果。

【技术实现步骤摘要】
一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的菌株及其应用


[0001]本专利技术涉及一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的菌株及其应用，属于微生物


技术介绍

[0002]聚唾液酸(Polysialic acid，PSA)是由N
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乙酰神经氨酸(Neu5Ac)单体以α
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2,8和/或α
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2,9糖苷键直接或间接连接而成的。基于PSA的无免疫原性和较好的可生物降解性等优点，它成为一种较为理想的药物缓释材料载体，广泛作为脑科手术和中枢神经细胞的修复手术中医用支架材料的最佳替代品。PSA生物降解后生成的Neu5Ac可以用作前体物质合成药物，因而PSA的制备及其相应的衍生物的生产应用正引起越来越多的关注。
[0003]目前，PSA只能用微生物发酵法得到，一般选用大肠杆菌，例如E.coli K1、E.coli SA
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8和E.coli K235等。发酵法使用的材料廉价且条件适宜菌株生长，有利于工业扩大规模生产，具有一定的发展潜力。目前，关于PSA的合成研究尚处于蓬勃发展阶段，且多集中在菌株发酵条件、产物提取纯化等方面，高效菌株的选育方面尚有较大提升空间。
[0004]随着市场需求的增长，PSA及其衍生物的规模化生产制备受到了更多的科学家的关注。世界多家科研和生产机构先后开展了通过细菌发酵产PSA的技术研究。Rodriguez
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Aparicio等发现，PSA的合成过程受到高温和溶氧量的严重影响，因此，该团队通过完善合成一个优选培养基，使发酵产PSA的产量达到了1.3g/L。Rode等随后改善了E.coli K1的培养条件，产量达1.5g/L。郭良栋等人使用E.coli C8菌株发酵得到的产量为1.2g/L。然而以上菌株依然存在着PSA产量较低的问题，其中的原因之一就是：在发酵过程中，大肠杆菌自身会产生一定的有机酸副产物，同时产物聚唾液酸也是酸性，使得发酵体系有趋向酸性的趋势，过量积累的酸性物质会对大肠杆菌造成一定的抑制，从而限制进一步的高产预期。为克服该弊端，现有方法是向发酵体系中添加大量的碱性物质。一方面，增加了生产成本，另一方面，添加的碱性物质也会造成发酵体系成分进一步复杂，提高产物回收和纯化难度，同时，也增大了发酵废水的环保处理负担。因此，急需提供一种能够耐受酸性环境、产聚唾液酸的大肠杆菌。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术提供一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的菌株及其应用。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78(Escherichia coli K78)，该菌株于2022年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.63055，地址：广州市越秀区先烈中路100号59号楼。
[0008]根据本专利技术优选的，所述大肠杆菌K78是以大肠杆菌K2(Escherichia coli K2)为出发菌株，进行紫外线诱变和ARTP诱变后，再经筛选获得。
[0009]进一步优选的，所述大肠杆菌K2(Escherichia coli K2)于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.63030，地址：广州市越秀区先烈中路100号59号楼。
[0010]进一步优选的，所述紫外线诱变和ARTP诱变具体是：先进行2轮紫外线诱变，选取优势菌后再进行2轮ARTP诱变；然后以此4轮诱变为一次，共进行3次。
[0011]根据本专利技术优选的，所述紫外线诱变的具体步骤如下：
[0012](1)将大肠杆菌K2在琼脂固体培养基上进行划线纯化培养后，挑取单菌落培养到对数生长期，然后将菌液离心去上清，悬浮于生理盐水中，制成菌悬液；
[0013](2)将步骤(1)得到的菌悬液搅拌震荡后，在紫外灯下照射100s，得到突变菌株；
[0014](3)将突变菌株在LB固体培养基和酸性PSA发酵培养基中进行筛选，筛选标准为聚唾液酸产量，得到优势菌株。
[0015]根据本专利技术优选的，所述ARTP诱变的具体步骤如下：
[0016]1)将紫外线诱变所得优势菌株在LB液体培养基中培养至OD600值为0.6～0.8，得到待诱变菌液；
[0017]2)将待诱变菌液均匀涂布于金属片表面，在ARTP诱变育种仪中诱变260s，经洗脱和培养后，得到突变菌株；所述ARTP诱变育种仪的仪器功率为110～130W、温度为18～22℃、氦气气量为8～12slm/s；
[0018]3)将突变菌株在LB固体培养基和酸性PSA发酵培养基中进行筛选，筛选标准为聚唾液酸产量，得到具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78。
[0019]根据本专利技术优选的，步骤(3)和步骤3)中，所述LB固体培养基pH为4.0～4.5；所述酸性PSA发酵培养基的起始pH为5.5。
[0020]上述大肠杆菌K78在生产聚唾液酸中的应用。
[0021]有益效果：
[0022]本专利技术以大肠杆菌K2为出发菌株，通过紫外线诱变和ARTP诱变进行菌株突变，再利用酸性条件筛选得到了一株具有优良耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78。该菌株在中性(起始pH为7.4)和酸性条件(起始pH为5.5)下聚唾液酸产量分别达到了1.736g/L和1.578g/L，是出发菌株的5.36倍和5.93倍。并且该菌株在酸性条件下的聚唾液酸产量相比于中性条件仅下降9％，进一步说明该菌株具有优良耐酸能力，同时高产聚唾液酸。并且在酸性培养基发酵罐中，聚唾液酸产量可达到6.86g/L，说明大肠杆菌K78可稳定工业化生产PSA。这有利于降低聚唾液酸的生产成本，克服发酵过程碱液大量消耗的弊端，对聚唾液酸的高效、绿色生产具有显而易见的有益效果。
附图说明
[0023]图1为不同突变菌株遗传稳定性测定。
[0024]图2为中性PSA发酵培养基中不同菌株发酵液PSA产量曲线。
[0025]图3为酸性PSA发酵培养基中不同菌株发酵液PSA产量曲线。
[0026]图4为大肠杆菌K78在酸性培养基发酵罐培养的大肠杆菌K78生物量和PSA产量曲线。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明，但本专利技术所保护范围不限于此。
[0028]实施例中，所述大肠杆菌K78(Escherichia coli K78)于2022年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.63055，地址：广州市越秀区先烈中路100号59号楼。所述大肠杆菌K2(Escherichia coli K2)于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No.63030，地址：广州市越秀区先烈中路100号59号楼。
[0029]实施例中培养基的配制原料均为本领域常用原料，可在市场购得。
[0030]实施例1、突变菌株的获得
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78(Escherichia coli K78)，其特征在于，该菌株于2022年12月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo.63055，地址：广州市越秀区先烈中路100号59号楼。2.如权利要求1所述的具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78，其特征在于，所述大肠杆菌K78是以大肠杆菌K2(Escherichia coli K2)为出发菌株，进行紫外线诱变和ARTP诱变后，再经筛选获得。3.如权利要求2所述的具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78，其特征在于，所述紫外线诱变和ARTP诱变具体是：先进行2轮紫外诱变，选取优势菌后再进行2轮ARTP诱变；然后以此4轮诱变为一次，共进行3次。4.如权利要求2所述的具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78，其特征在于，所述大肠杆菌K2(Escherichia coli K2)于2022年12月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo.63030，地址：广州市越秀区先烈中路100号59号楼。5.如权利要求2所述的具有耐酸能力、产聚唾液酸的大肠杆菌K78，其特征在于，所述紫外线诱变的具体步骤如下：(1)将大肠杆菌K2在琼脂固体培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱德强，王崇川，常化难，刘新利，李宁，袁卫涛，曹建帮，高学秀，
申请(专利权)人：山东星光首创生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：