一种促进化脓隐秘杆菌生长的细菌培养基制造技术

本发明专利技术提供一种化脓隐秘杆菌的培养基，所述的培养基是在基础培养基中添加有奶牛子宫内膜间质细胞破碎液。本发明专利技术的培养基能够使化脓隐秘杆菌生长更快，在该细胞培养基上培养24小时即可产生可见菌落，培养40小时产生的菌落数显著高于其它含血液/血清的细菌培养基，且无外源性污染。无外源性污染。无外源性污染。

【技术实现步骤摘要】
一种促进化脓隐秘杆菌生长的细菌培养基


[0001]本专利技术属于微生物培养基
，具体涉及一种用于培养化脓隐秘杆菌快速生长的细菌培养基。

技术介绍

[0002]化脓隐秘杆菌是引起家畜乳房炎、子宫内膜炎、肺炎等感染性疾病的重要病原菌之一，给养殖业带来了较大的损失。据报道我国90％以上的奶牛子宫内膜炎由病原微生物引起，经鉴定其中23.5％的微生物是化脓隐秘杆菌。因此，深入研究和探索化脓隐秘杆菌与宿主的互作关系，不仅对防治奶牛子宫内膜炎具有指导意义，而且可为控制病原菌的传播提供重要理论依据。
[0003]作为一种兼性厌氧菌，化脓隐秘杆菌的生长增殖速度较慢，需要营养丰富的培养基。化脓隐秘杆菌的最适生长温度为37℃，血液和血清可促进其生长。产生的菌落透明，周围有溶血，大小为1mm。虽然含血液或血清的培养基能够培养化脓隐秘杆菌，但其生长速度较慢，很难在短时间内获得足够的细菌数量。而且由于培养基中添加大量血液/血清，给单纯的化脓隐秘杆菌扩繁培养带来了不确定因素，如引入细菌、病毒、支原体或衣原体等动物源性污染。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供一种克服上述问题的无血液/血清的化脓隐秘杆菌的培养基，能够使化脓隐秘杆菌生长更快，在该细胞培养基上培养24小时即可产生可见菌落，培养40小时产生的菌落数显著高于其它含血液/血清的细菌培养基，且无外源性污染。
[0005]本专利技术首先提供一种用于培养化脓隐秘杆菌快速生长的培养基，所述的培养基是在基础培养基中添加有奶牛子宫内膜间质细胞破碎液；
[0006]所述的奶牛子宫内膜间质细胞破碎液，是将奶牛子宫内膜间质细胞超声破碎后获得的上清液；
[0007]更进一步的，所述的奶牛子宫内膜间质细胞破碎液在培养基中的添加的体积百分比浓度为0.1～0.5％；即以1000mL体积的溶液为例，在999mL的培养基中加入1mL细胞破碎液。
[0008]所述的基础培养基，其中包含有质量体积百分比浓度为0.5％的胰蛋白胨、0.25％的酵母提取物和0.5％的氯化钠；
[0009]本专利技术再一个方面还提供一种培养化脓隐秘杆菌的方法，是使用上述的培养基来进行培养；
[0010]所述的方法，是将化脓隐秘杆菌冻干菌种用含脑心浸液肉汤完全溶解复苏后，再接种到添加有奶牛子宫内膜间质细胞破碎液的培养基中进行培养，培养温度为37℃，振荡频率200～250r/min，培养24～48h。
[0011]本专利技术提供的培养基和培养方法，具有如下优点：
[0012]1)本专利技术提供的培养基，使化脓隐秘杆菌的生长状态良好，极大的促进了化脓隐秘杆菌的生长速度，能在短时间内获得足够多的化脓隐秘杆菌。
[0013]2)本专利技术提供的培养基排除了动物血清/血液引入细菌、病毒、支原体或衣原体污染的可能。
[0014]3)本专利技术提供的培养基配方简单、成本低，更利于化脓隐秘杆菌扩繁培养。
附图说明
[0015]图1：对比例1和实施例1的化脓隐秘杆菌生长曲线进行对比图。
[0016]图2：40h时化脓隐秘杆菌在仅含有血清的培养基中生长状况图。
[0017]图3：40h时化脓隐秘杆菌在仅含有细胞破碎液的培养基中生长状况图。
[0018]图4：在含血清和韩细胞破碎液的培养基中生长40h后，化脓隐秘杆菌的总菌落数统计图。
具体实施方式
[0019]目前化脓隐秘杆菌培养时由于培养基中需添加大量血液/血清，给化脓隐秘杆菌的扩繁培养增加了引入动物源性污染，如细菌、病毒和支原体衣原体等风险。且在已有的基础培养基中，化脓隐秘杆菌的生长速度较慢，短时间内很难达到实验要求的数量。因此，本专利技术向基础培养基中加入奶牛子宫间质细胞破碎液，能够减少动物源性污染，而且使化脓隐秘杆菌生长更稳定、速度更快。
[0020]下面结合实施例和附图对本专利技术进行详细的描述。
[0021]实施例1：配制培养基及效果检测
[0022]一、配制培养基：
[0023]1、制备化脓隐秘杆菌培养基，包括如下步骤：
[0024]步骤1，细胞破碎液的制作：
[0025]将奶牛子宫内膜间质细胞解冻复苏后，用EMEM培养液在37℃培养箱中培养至细胞量约为5
×
106个/mL(以6cm的细胞培养板为例)，选取对数生长期的间质细胞，用无菌的PBS润洗两遍后，加入1mL超纯水后用细胞刮刀将培养皿中的细胞刮下，置于冰上，在超声波破碎仪下进行破碎(200w，振幅60％，脉冲50％，超声时间10秒)，破碎后12000g高速离心3分钟，收集上清，得到细胞破碎液置于4℃暂存。
[0026]步骤2，称取以下原料：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，氯化钠5g；
[0027]步骤3，用超纯水对上述原料进行溶解并定容到1000mL；
[0028]步骤4，在121℃高压灭菌15min；
[0029]步骤5，待培养基温度降至60℃后，取999mL培养基加入1mL细胞破碎液，获得细胞破碎液细菌培养基。
[0030]2、对比例1的培养基的制备步骤如下：
[0031]步骤1，称取以下原料：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，氯化钠5g；
[0032]步骤2，采用超纯水对上述原料进行溶解并定容到1000mL；
[0033]步骤3，在121℃高压灭菌15min；
[0034]步骤4，待培养基温度降至60℃后，取990mL培养基加入10mL羊血清配置成含血清
液体培养基。
[0035]二、生长曲线测定：
[0036]步骤1，将化脓隐秘杆菌复苏，过夜培养后(培养10～12h)，吸取培养后2.5mL培养液，转入盛有60mL细胞破碎液培养基的三角瓶内，将其混匀稀释后，分别取5mL混合液加至上述标记的8支无菌大试管中。
[0037]步骤2，将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率200～250r/min)，分别培养0，1，3，5，7，9，11，13h后，取出相应试管置于4℃暂存，最后比浊测定各管光密度值。
[0038]步骤3，以未接种的液体培养基为空白对照,测定前将培养基混匀后用600nm波长进行光电比浊测定。
[0039]从图1中可以看出，接种1
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3h内，化脓隐秘杆菌在含血清培养基和含细胞破碎液培养基中的生长速度差异不显著，但接种培养5h后，化脓隐秘杆菌在含细胞破碎液培养基中的生长速度比在含血清培养基中的生长速度增加约1.5倍。
[0040]三、40h菌落总数检测:
[0041]1、含血清的培养基培育化脓隐秘杆菌：
[0042]步骤1，称取以下原料：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，氯化钠5g，琼脂2g；
[0043]步骤2，采用超纯水对上述原料进行溶解并定容到1000mL；
[0044]步骤3，在121℃高压灭菌15min；
[0045]步骤4，待培养基温度降至60℃后，取990mL培养基加入10mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于培养化脓隐秘杆菌快速生长的培养基，其特征在于，所述的培养基是在基础培养基中添加有奶牛子宫内膜间质细胞破碎液。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的奶牛子宫内膜间质细胞破碎液，是将奶牛子宫内膜间质细胞超声破碎后获得的上清液。3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的奶牛子宫内膜间质细胞破碎液在培养基中的添加的体积百分比浓度为0.1～0.5％。4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的基础培养基，其中包含有质量体积百分比浓度为0.5％的胰蛋白胨、0.25％的...

【专利技术属性】
技术研发人员：付开强，闫雪莹，陈韩，郭月，仲佳兴，曹荣峰，朱士勇，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：