AAV5扩容衣壳突变体及其扩容检测方法技术

本公开提供了一种AAV衣壳蛋白突变体，所述AAV衣壳蛋白突变体相比于野生型衣壳蛋白具有更大的包装容量。另外本公开还提供了一种检测将编码前述AAV衣壳蛋白突变体氨基酸的核酸序列引入多个细胞中后，赋予与野生型AAV相比更大的包装容量的方法。通过本公开所提供的内容，可以获得一种定量误差小、准确且稳定性好的AAV滴度定量方法。的AAV滴度定量方法。

【技术实现步骤摘要】
AAV5扩容衣壳突变体及其扩容检测方法


[0001]本公开涉及生物
，具体涉及AAV5扩容衣壳突变体及一种通过数字PCR检测病毒全长基因表达盒占比的方法。

技术介绍

[0002]腺病毒是最早发现的病毒之一，但在20世纪60年代，电子显微镜下显示腺病毒样品通常含有一种较小的颗粒(25nm左右)，1965年被分类为第二种病毒，即腺相关病毒(AAV)。AAV是一种依赖病毒，是腺病毒以及某些疱疹病毒的附属病毒，目前认为AAV是一种非致病病毒。由于其相对简单的基因组和非致病性，AAV作为基因治疗载体已被应用于临床(Ritti
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,Laure,et al.Molecular Therapy 27.10(2019):1706
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1717.)。AAV载体目前主要采用以血清型为主，结合亚型和变种的分类法。简单来说，就是按AAV不同来源和外壳特性选择不同的分类法。天然的AAV采用常规系统分类法(例如：AAV2、AAV5、AAV9)；通过杂交包装(cross packaging)产生的非天然AAV则按亚型分类法进行划分(例如：AAV2/8、AAV2/5)；对于那些采用其他手段(如外壳核酸序列突变)得到的新型非天然AAV则按变种分类法划分为不同变种或隔离种(例如：AAV2/7m8、AAV PHP.B、AAV DJ)。
[0003]AAV颗粒直径25nm左右，衣壳由60个衣壳蛋白亚单位构成，排列成二十面体结构。二十面体是由20个三角形围成的凸多面体，每5个三角形围出一个五倍顶，通过每一对相对着的五倍顶有一个五倍旋转对称轴，通过每一对相对着的三角形中心有1个三倍旋转轴，通过每一对相对着的棱的中点有1个二倍旋转轴(Zhang,Ran,et al.Nature microbiology 4.4(2019):675
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682.)。wtAAV基因组为线性、单链的DNA分子，wtAAV基因组全长约4.7Kb，基因组的两端包含相同的约150个核苷酸(nt)的反向末端重复(ITR)，形成T形发夹二级结构，对基因组复制和包装很重要(Bennett,et al.Future Virology 12.6(2017):283
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297.)。在ITR之间，两个开放阅读框(ORF)编码Rep蛋白、病毒衣壳VP蛋白(VP1，VP2和VP3)，以及两个较小的辅助蛋白：AAP和MAAP。对于重组AAV(rAAV)载体，病毒基因组ORF被感兴趣的治疗基因(或称为目的基因)替换，仅保留侧翼ITR。通过反式提供rAAV包装所需的Rep蛋白和VP蛋白(Grieger,et al.Methods in enzymology 507(2012):229
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254.)。
[0004]目前，已有几款AAV药物获批上市，例如：(1)由荷兰UniQure公司开发的一款基于腺相关病毒的基因疗法，于2012年获EMA批准上市，用于治疗家族性脂蛋白脂肪酶缺乏症(Scott,et al.Drugs 75.2(2015):175
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182.)；(2)是由罗氏旗下Spark Therapeutics公司开发的AAV基因疗法，于2017年获美国FDA批准，用于治疗双等位基因RPE65突变造成的视力丧失遗传性视网膜营养不良。该药是一种携带正常RPE65基因的非复制型重组AAV2，通过视网膜下注射，让患者视网膜部位细胞表达正常的RPE65蛋白，从而改善患者视力(Lloyd,Andrew,et al.British Journal of Ophthalmology 103.11(2019):1610
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1614.)；(3)是由Novartis公司旗下AveXis公司开发，用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)，已于2019年获美国FDA批准上市。该药物以AAV9为基因载体，而AAV9能够跨越血脑屏障，因而该药物可直接被递送至中枢神经系统运动神经元，增加体内SMN蛋白表达水
平，从而治疗SMA(Waldrop,Megan A.,and Stephen J.Current treatment options in neurology 21.6(2019):1
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11.)。
[0005]AAV载体优势为(1)安全性高，无致病性，低免疫原性；(2)表达时程长，长时间高效稳定表达；(3)嗜性广，可以感染分裂细胞及非分裂细胞(神经元)、多种血清型AAV实现不同组织器官靶向。AAV载体局限之一为：外源基因容载能力有限，不同血清型AAV包装容量有差异，目前，普遍认为AAV的包装容量不超过5Kb，包装体系的目的片段在5Kb及其以上时，主要包装进AAV5衣壳的是小于5Kb的不完整片段，这在一定程度上限制了AAV载体在长片段目的基因方面的应用(Samulski,Richard Jude.Nature biotechnology 18.5(2000):497
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498.)，例如F8因子表达框、cas9
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gRNA蛋白表达框、抗肌萎缩蛋白表达框等长度往往超过5K。因此，增加AAV的包装容量对于一些疾病的基因治疗具有重要意义。
[0006]鉴于DNA在生理状态下含负电荷，增加AAV衣壳腔室内的氨基酸所带正电荷或降低其所带的负电荷，降低AAV衣壳蛋白与其基因组DNA之间的电荷斥力或增加它们之间的电荷引力，也许可使DNA以更紧凑的方式包装，从而增加AAV衣壳的包装容量。
[0007]数字PCR(dPCR)被称为第三代PCR技术，作为一种新兴技术与旧的PCR技术(例如实时定量PCR)相比，可针对核酸分子做更精确的定量分析(Pinheiro LB,et al.Anal Chem.2012；84(2):1003
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11.)。数字PCR的创新之处在于标准PCR反应体系经过微滴发生，将目标分子稀释到多个微滴中，每个微滴大体上只包含一个或不包含目标DNA模板，实现”单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有目标分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。因此，无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量。dPCR被广泛应用于病毒载体滴度(例如：被用于定量慢病毒载体滴度、AAV载体滴度、腺病毒载体滴度等)测定。
[0008]相对于传统的qPCR方法，dPCR在定量准确性、灵敏度及稳定性方面具有显着优势。更准确可靠的病毒载体滴度对毒理学及临床相关的给药剂量范围研究至关重要。若滴度定量虚高，则实际药效可能太低，可能无疗效；若滴度定量虚低，则可能导致严重的副作用，例如细胞因子风暴。
[0009]以AAV滴度检测为例，AAV滴度检测一般不对基因组进行抽提操作，且在定量其滴度前，需要用DNA酶I对其进行消化处理，以降低游离DNA对AAV定量的影响。另外，若是AAV粗品，则其中会含有大量的核酸、杂质蛋白等生物大分子，因此，无论是AAV纯品还是粗纯产品，其样本PCR反应体系中都会含有相对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种AAV衣壳蛋白突变体，所述AAV衣壳蛋白突变体包含与AAV亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列相比，具有在对应于如SEQ ID NO.1所示亲本或野生型AAV衣壳蛋白的氨基酸序列中第219位、第228位、第301位和第679位的一个或多个氨基酸位置处具有氨基酸突变的氨基酸序列，所述AAV衣壳蛋白突变体相比于野生型衣壳蛋白具有更大的包装容量；优选地，所述突变体在第219位具有H219R突变；优选地，所述突变体在第228位具有R228H突变；优选地，所述突变体在第301位具有S301K或S301R突变；优选地，所述突变体在第679位具有N679R突变；优选地，所述突变体在第219位具有H219R突变，在第228位具有R228H突变，在第301位具有S301K或S301R突变、在第679位具有N679R突变。2.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体，其中所述AAV亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列是血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12及其任意组合的氨基酸序列，优选地，所述AAV亲本或野生型衣壳蛋白的氨基酸序列是血清型AAV5的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的AAV衣壳蛋白突变体，其中所述AAV亲本或野生型AAV衣壳蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或者与其有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的AAV衣壳蛋白突变体，其中所述AAV衣壳蛋白突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％或以上同一性的氨基酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的氨基酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或者具有在SEQ ID NO.3上缺失、添加或取代1、2或3个氨基酸所得到的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸具有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列或者具有在SEQ ID NO.5上缺失、添加或取代1、2或3个氨基酸所得到的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸具有SEQ ID NO.7所示氨基酸序列或者具有在SEQ ID NO.7上缺失、添加或取代1、2或3个氨基酸所得到的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸具有SEQ ID NO.9所示氨基酸序列或者具有在SEQ ID NO.9上缺失、添加或取代1、2或3个氨基酸所得到的氨基酸序列；优选地，所述氨基酸具有SEQ ID NO.11所示氨基酸序列或者具有在SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓亮，田文洪，周庆璋，师晓强，田磊，赵君竺，赵春林，
申请(专利权)人：北京安龙生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：