检测脑炎相关病原体的组合物、试剂盒，方法及用途技术

本发明专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及脑炎相关病原体的检测，更具体地，涉及屎肠球菌、粪肠球菌和乙型脑炎病毒的检测。本发明专利技术提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的检测和区分。本发明专利技术的组合物，其检测的灵敏度更高，达到100拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。检测更为准确。检测更为准确。

【技术实现步骤摘要】
检测脑炎相关病原体的组合物、试剂盒，方法及用途


[0001]本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及不同类型脑炎相关病原体的检测，更具体地，涉及屎肠球菌、粪肠球菌和乙型脑炎病毒的检测。

技术介绍

[0002]肠球菌属细菌是寄居于人体和动物肠道内的正常菌群，异位寄生可致尿路感染、呼吸道感染、伤口感染、心内膜炎、脑炎、脑膜炎和败血症等。近年以来，由粪肠球菌与屎肠球菌导致的疾病逐渐增加，特别是粪肠球菌与屎肠球菌导致脑膜炎病例的出现，无疑是给人类与动物的健康带来了严重的威胁，目前在已研究的细菌性脑膜炎病例中，毒力因子在引起炎症、破坏血脑屏障通透性等方面发挥重要作用，但粪肠球菌与屎肠球菌破坏脑组织结构、引起脑膜炎、脑炎的机制尚不清除。
[0003]流行性乙型脑炎是常见的中枢神经系统感染性疾病，由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)感染引起，疾病的死亡率和致残率均较高。JEV感染并突破血脑屏障、进入中枢神经系统后，直接靶向神经元并引起神经元的损伤。目前研究认为JEV引起神经元损伤的相关因素包括炎症反应、细胞凋亡、内质网应激等，具体的机制尚不十分清楚。
[0004]可见，粪肠球菌与屎肠球菌和乙型脑炎病毒都能够通过特定的方式参与脑炎疾病的发展，由于上述三种病原体诱发脑炎疾病的方式、病原体耐药性不同，因此需要针对具体的病原体制定有效的脑炎疾病治疗策略。
[0005]因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述不同的病原体，以便为后续治疗提供针对性的策略，并且灵敏度高，特异性好。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，第一方面，本专利技术提供一种不同类型病原体检测的组合物，包括：
[0007]如SEQ ID NO:1～3所示的检测屎肠球菌的上游引物、下游引物及探针；
[0008]如SEQ ID NO:4～6所示的检测粪肠球菌的上游引物、下游引物及探针；以及
[0009]如SEQ ID NO:7～9所示的检测乙型脑炎病毒的上游引物、下游引物及探针。
[0010]本专利技术提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同靶点，对不同类型的病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性的策略。本专利技术的组合物，其检测的灵敏度更高，达到100拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
[0011]进一步地，所述组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
[0012]在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。
[0013]在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
[0014]进一步地，本专利技术组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
[0015]在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO 425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
[0016]在一些具体的实施方案中，屎肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；粪肠球菌探针的荧光报告基团为HEX；乙型脑炎病毒探针的荧光报告基团为ROX；内标的荧光报告基团为CY5。
[0017]进一步地，在一些实施方案中，本专利技术的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本专利技术中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
[0018]本专利技术的组合物可以任意组合成检测对应4个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本专利技术中。
[0019]举例来说，可以包括上述4对引物和探针中的任意3对，可以包括上述4对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述4对引物和探针中的任意1对。
[0020]在一些具体的实施方案中，本专利技术组合物用于荧光PCR。
[0021]进一步地，探针的3
’
末端还具有非荧光淬灭剂。
[0022]进一步地，探针的3
’
末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
[0023]在一个具体的实施方案中，探针的3
’
末端为BHQ1。
[0024]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
[0025]在一个具体的实施方案中，本专利技术的组合物的各成分存在于同一个包装中。
[0026]进一步地，本专利技术的组合物的各成分以混合的形式存在。
[0027]第二方面，本专利技术提供了上述本专利技术的组合物在制备不同类型病原体检测的试剂盒中的用途，其中，所述病原体为屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒。
[0028]第三方面，本专利技术提供了一种检测不同类型病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本专利技术的组合物。
[0029]进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
[0030]在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是屎肠球菌、粪肠球菌、乙型脑炎病毒的片段质粒或片段DNA中的至少一种。
[0031]进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0032]更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。
[0033]更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、UNG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg
2+
中的至少一种。
[0034]进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
[0035]在一个具体的实施方案中，本专利技术试剂盒包括Taq酶、Mg
2+
、dNTP(U)s、引物、探针和
PCR缓冲液。
[0036]常见的PCR缓冲液由Tris
‑
HCl、MgCl2、KCl、Triton X
‑
100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
[0037]在一个具体的实施方案中，本专利技术试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
[0038]第四方面，提供了一种检测不同类型病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0039]1)提取或释放待测样本的核酸；
[0040]2)使用如上所述本专利技术的组合物或上述本专利技术的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
[0041]3)获得并分析结果。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种不同类型病原体检测的组合物，包括：如SEQ ID NO:1～3所示的检测屎肠球菌的上游引物、下游引物及探针；如SEQ ID NO:4～6所示的检测粪肠球菌的上游引物、下游引物及探针；以及如SEQ ID NO:7～9所示的检测乙型脑炎病毒的上游引物、下游引物及探针。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括如SEQ ID NO:10～12所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，屎肠球菌探针的荧光报告基团为FAM；粪肠球菌探针的荧光报告基团为HEX；乙型脑炎病毒探针的荧光报告基团为ROX；内标的荧光报告基团为CY5。5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王维，万旺，殷仑仑，任小梅，吴康，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：