检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物组合制造技术

本发明专利技术公开了一种检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物组合，本发明专利技术根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区，设计引物和探针，构建单管多重实时PCR体系，对痰液等样本进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变检测，该引物探针组合可检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区gyrA基因和gyrB基因中对应的6个氨基酸位点的密码子，涵盖13种耐药突变类型，基于检测结果，可判断是否产生了耐药突变以及具体的突变类型，此外还可以用于异质性耐药的检测，监控用药前后，患者体内野生型菌株与耐药突变型菌株的比例，可为结核分枝杆菌感染的患者提供更为准确科学的辅助诊疗依据。准确科学的辅助诊疗依据。准确科学的辅助诊疗依据。

【技术实现步骤摘要】
检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物组合


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于双标记寡核苷酸探针溶解曲线法检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物及方法。

技术介绍

[0002]结核病(tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病，在全世界广泛流行。目前，结核病仍是全球重要的公共卫生问题，全球每年新发结核病患者达1060万例。其中，敏感结核病的治疗成功率＞90％，而全球耐药结核病的治愈率仅为50％左右。耐药患者的治疗一直是国内外关注的重点。目前我们所说的耐药结核病，包括利福平耐药(RR
‑
TB，对利福平耐药，不论对其他抗结核药物是否耐药)、耐多药结核病(MDR
‑
TB，对包括异烟肼和利福平在内的至少两种以上一线抗结核药物耐药)、准广泛耐药结核病(Pre
‑
XDR
‑
TB,符合MDR
‑
TB/RR
‑
TB定义，同时对任意一种氟喹诺酮类药物耐药)及广泛耐药结核病(XDR
‑
TB，符合MDR
‑
TB/RR
‑
TB定义，同时对任意一种氟喹诺酮类药物耐药和贝达喹啉、利奈唑胺至少一种耐药)。耐药结核病与普通结核病相比，耐药结核病诊断复杂、治疗困难，疗程长，疗效差，费用高。因此，耐药结核病的诊断是结核病防控的关键一环，是实现“终止结核病”的重中之重。
[0003]目前，MDR
‑
TB和XDR
>‑
TB的治疗非常困难。抗结核药物氟喹诺酮类药物(FQ)被广泛用于治疗耐多药结核病。FQs耐药通常与编码DNA促旋酶的gyrA和gyrB基因的突变有关。到目前为止，已知有21个与gyrA突变相关的SNP位点和29个与gyrB相关的SNP位点，已被用于基因型对FQ耐药的敏感性预测分析。其中明确与耐氟喹诺酮药物相关的耐药位点主要集中在gyrA基因中第88位、90位、91位和94位氨基酸对应的密码子，以及gyrB基因中应第499位和501位氨基酸对应的密码子。氟喹诺酮类药物的长期使用，它会伴随着抗药性的产生，需要发展早期、灵敏、准确的检测技术进行监测。
[0004]耐药结核病的诊断技术主要分为两大类：第一类是表型方法(罗氏培养基比例法、H710/11比例法、MGIT960)；第二类是基因型方法(分子信标、反向杂交、溶解曲线)，相比于基因型方法，表型方法是耐药诊断的金标准，检测药物较多，同时也存在检测周期长，生物安全需求高等缺点，不利于耐药结核病的快速诊断。而基因型方法有着检测周期短，检测的结果重复性好，生物安全低的优势，已经被广泛使用。目前，市面上应用的结核耐药分子诊断试剂存在一些问题；例如CN201110137832.4不可区分氟喹诺酮耐药的具体突变位点类型；CN202211491843.7仅能检测gyrA基因，无法覆盖现有的主要耐药突变位点。此外，现有的结核耐药分子诊断试剂还存在检测时间长，成本高，检测灵敏度不高、特异性不强等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的引物组合，该引物基于双标记寡核苷酸探针溶解曲线分析技术，能快速、灵敏、特异的检测结核分枝杆菌氟喹诺酮
耐药突变。
[0006]上述专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0007](1)提取结核分枝杆菌样本DNA；
[0008](2)根据结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药决定区(QRDR)，利用引物设计软件Primer 5设计引物和探针；
[0009]所述设计引物探针的具体方法如下：
[0010]A、引物设计在gyrA基因、gyrB基因所覆盖检测突变位点的两端，探针覆盖突变位点；
[0011]B、所述探针共有3条，Probe A：覆盖gyrA基因对应第88位、90位、91位氨基酸的密码子，5
’
端标记FAM，3
’
端标记BHQ1；Probe B：覆盖gyrA基因对应第94位氨基酸的密码子，5
’
端标记ROX，3
’
端标记BHQ2；Probe C：覆盖gyrB基因第499位、501位氨基端的密码子，5
’
端标记HEX，3
’
端标记BHQ1。此外，为了更好地区分野生型菌株与突变型菌株，采用LNA修饰主要突变位点。
[0012]所述引物和探针具体序列为：
[0013]gyrA
‑
F：5
’‑
TGCCGAGACCATGGGCAAC
‑3’
[0014]gyrA
‑
R：5
’‑
GAAGTTGCCCTGGCCGTC
‑3’
[0015]gyrB
‑
F：5
’‑
CAATGTGGAGAAAGCGCGC
‑3’
[0016]gyrB
‑
R：5
’‑
CTTGCCGATATCGAACTCGTC
‑3’
[0017]Probe A：5
’‑
FAM
‑
ACGGCGACGCGTCGA
‑
BHQ1
‑3’
[0018]Probe B：5
’‑
ROX
‑
TACGACAGCCTGGTGCGCAT
‑
BHQ2
‑3’
[0019]Probe C：5
’‑
HEX
‑
AAAGAACACCGAAGTTCAGGCG
‑
BHQ1
‑3’
；
[0020](3)选择氟喹诺酮最常见的突变位点gyrAAsp94Asn(GAC>AAC)为研究对象，建立单重单色实时PCR体系，进行结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变的PCR检测，比较待测样本与野生型阳性标准品之间的溶解曲线的熔点(Tm值)差异，判断样本是否发生突变以及突变类型。
[0021]所述单管单色实时PCR体系为：25μL PCR反应体系包含1
×
PCR buffer(10mM Tris
‑
HCl，pH8.6、50mM KCl，5％甘油)、2.0mM MgCl2、dNTP Mix 0.2mM、2U Titanium Taq DNAPolymerase、0.06μM gyrA
‑
F、0.6μM gyrA
‑
R、0.4μM probe
‑
B；
[0022]所述PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性10s，58℃退火15s，63℃延伸25s，55个循环，58℃15s处收集荧光信号；95℃变性2min；45℃保温2min；45℃～90℃，以每0.1℃的升温速率从45℃
‑
90℃进行溶解曲线分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组引物在制备检测结核分枝杆菌氟喹诺酮耐药突变试剂中的应用，所述引物如下：gyrA
‑
F：5
’‑
TGCCGAGACCATGGGCAAC
‑3’
gyrA
‑
R：5
’‑
GAAGTTGCCCTGGCCGTC
‑3’
gyrB
‑
F：5
’‑
CAATGTGGAGAAAGCGCGC
‑3’
gyrB
‑
R：5
’‑
CTTGCCGATATCGAACTCGTC
‑3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏雪山，张敏，冯悦，刘高文，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：