蛋白质与配体相互作用的鉴定和监测方法技术

本发明专利技术总体上涉及生物化学领域。特别地，本发明专利技术涉及检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括使包含一种或多种细胞的样品与细胞渗透性变性剂接触，以促进样品中靶标的细胞内去折叠，然后裂解样品。然后检测或测定裂解样品的非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或者聚集性靶标水平的差异表明样品中结合配体的靶标的存在或水平。在具体实施方案中，细胞渗透性变性剂是尿素或其衍生物。其中还提供了鉴定候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质与配体相互作用的鉴定和监测方法


[0001]本专利技术总体上涉及生物化学领域。特别地，本专利技术涉及检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法。本文还提供了鉴定候选配体或预测药物在受试者中的疗效的方法。

技术介绍

[0002]鉴定和监测蛋白质化学相互作用的能力在生物学、化学和药物发现方面有许多重要应用。例如，在筛选用于药物发现和后续开发的大型化学文库时，监测蛋白质化学相互作用是很重要的。了解药物与其他可能导致不良副作用的蛋白质脱靶相互作用也很重要。
[0003]然而，现有的识别和监测蛋白质化学相互作用的方法通常需要使用重组蛋白质和修饰的生物活性化合物。这可能会损害所获得数据的生理相关性。例如，用重组蛋白筛选和鉴定的药物可能不会在细胞内与靶标结合。用重组蛋白鉴定的药物可能具有未知的脱靶活性，从而导致毒性。重组蛋白也可能在细胞外采用不同的结构构象，并且可能难以表达。此外，从表型药物筛选中鉴定的生物活性化合物的作用机制或蛋白质靶标通常是未知的。
[0004]因此，通常希望克服或改善上述一个或多个困难。

技术实现思路

[0005]本文公开了一种检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括：
[0006]a)使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠，
[0007]b)裂解样品；和
[0008]c)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。
[0009]本文公开了一种用于实施本文定义的方法的试剂盒。
[0010]本文公开了一种鉴定能够与靶标结合的候选配体的方法，所述方法包括：
[0011]a)使样品与候选配体接触；
[0012]b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；
[0013]c)裂解样品；以及
[0014]d)检测或测定所述非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，所述非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示所述候选配体能够结合所述靶标。
[0015]本文公开了一种预测药物在受试者中的疗效的方法，所述方法包括
[0016]a)从已经用所述药物治疗的受试者获得样品；
[0017]b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进靶标的细胞内去折叠；
[0018]c)裂解样品；
[0019]d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示药物与靶标的结合，从而预测药物在受试者中的疗效。
[0020]本文公开了一种鉴定受试者中与药物结合的靶标的方法，所述方法包括：
[0021]a)从已经用所述药物治疗的受试者获得样品；
[0022]b)使所述样品与细胞渗透性变性剂接触以促进所述靶标的细胞内去折叠；
[0023]c)裂解样品；以及
[0024]d)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标的水平的差异指示药物与靶标的结合。
附图说明
[0025]以下仅通过非限制性示例的方式，参照附图描述本专利技术的实施方案，其中：
[0026]图1：通用细胞图谱(UCEP)技术在药物发现中面临和解决的问题概述。
[0027]图2：图示说明了UCEP的基本工作流程，所述UCEP基于蛋白质在药物存在(和不存在)下的物理稳定性来鉴定药物靶蛋白。
[0028]图3：显示UCEP筛选系统工作流程的示意图。首先，使用Flp
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In T
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ReX或CRISPR技术产生报告细胞。然后，在大规模小分子筛选之前，针对理想的UCEP条件对报告细胞进行优化。
[0029]图4：摩尔浓度响应(MR)实验的UCEP
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介入(UCEP
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ENGAGE)的代表性印迹。所有实验都在一个生物重复中进行(n＝1)。GAPDH或α
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微管蛋白用作上样对照。(A)在3M、4M和5M条件下，MTX处理的可溶性DHFR丰度显著高于对照。这表明DHFR在K562细胞中被MTX强烈稳定。(B)在4M和5M条件下，MTX处理的可溶性TS丰度显著高于对照。说明MTX能稳定K562细胞中的TS。(C)在4M、5M和7M条件下，PAN处理的可溶性HDAC2丰度高于对照。这表明，在HEPG2细胞中，PAN对HDAC2具有稳定作用。(D)在3M至7M的尿素浓度下，达沙替尼(dasanitib)处理组的可溶性ABL激酶和BCR
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ABL融合蛋白的丰度显著高于DMSO处理的对照组。这表明ABL和BCR
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ABL蛋白都被达沙替尼稳定。
[0030]图5:UCEP剂量反应实验，用于确定MTX和PAN的靶标结合亲和力。(A)从0到40uM的MTX，DHFR带强度以剂量依赖的方式逐渐增加。(B)同样，在帕比司他(panobinostat)处理的细胞中也观察到可溶性HDAC2的丰度从0增加到10uM，其中GAPDH被用作上样对照。使用Image Lab对谱带强度进行半定量，并通过Graphpad拟合剂量
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反应曲线以计算EC50。
[0031]图6:MR实验的UCEP
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鉴定(UCEP
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ID)火山图。(A)K562中甲氨蝶呤的靶向去卷积(n＝1)。二氢叶酸脱氢酶(DHFR)被检测为MTX唯一的药物结合靶标。(B)HepG2中帕比司他的靶向去卷积(n＝1)。一些靶标通过了过滤标准，并被检测到被帕比司他稳定。它们是HDAC1、HDAC2、TTC38、HDAC6、CAVIN1、PAH和ADH5。(C)在稀释缓冲液中添加NP40的HepG2中帕比司他的靶向去卷积(n＝2)。ER膜蛋白FADS1和FADS2被鉴定蛋白质覆盖度增加。(D)K562中达沙替尼的靶向去卷积(n＝2)。已知的直接靶标，ABL和BTK激酶被检测为结合靶标。
[0032]图7:UCEP测定开发的验证。(A)在HEK293 DHFR
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HiBiT细胞中，在进行或不进行UCEP的情况下评估了五种不同化合物对蛋白质稳定性的影响。用20μM的化合物处理细胞10分钟。(B)选择性DHFR抑制剂甲氨蝶呤和氨基蝶呤的化学结构。(C)非DHFR抑制剂星形孢菌素(Staurosporine)、恩杂鲁胺(Enzalutamide)和帕比司他的化学结构。
[0033]DHFR:二氢叶酸还原酶
[0034]图8：不同化学变性剂的比较。HEK293 DHFR HiBiT细胞用20μM甲氨蝶呤处理10分钟，然后用UCeP处理。在UCeP中，使用3M尿素、正甲基脲、盐酸胍或硫氰酸胍。使用PBS作为载体。结果显示蛋白质稳定性发生了倍数变化。DHFR:二氢叶酸还原酶
[0035]图9：磁性微珠与离心法分离蛋白质聚集体的效率比较。结果表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测或测定与样品中配体结合的靶标的方法，所述方法包括：a)使样品与细胞渗透性变性剂接触以促进样品中靶标的细胞内去折叠，b)裂解样品；和c)检测或测定非聚集性靶标或聚集性靶标的水平，其中与参考相比，非聚集性靶标或聚集性靶标水平的差异指示样品中与配体结合的靶标的存在或水平。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括一种或多种细胞。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述样品是细胞或组织样品。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞渗透性变性剂是尿素或其衍生物(例如硫脲或甲基脲)。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述靶标是蛋白质。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤b)包括快速裂解和/或稀释所述样品以促进所述靶标的聚集。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法包括在步骤c)之前去除聚集的和/或未折叠的靶标。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括检测或测定在不同浓度的变性剂下配体与靶标的结合。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法在动物的生理温度下进行。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述靶标与标签偶联。11.根据权利要求1至10中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈顺兴，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：