PEMV-1、BYMV、BrYV一步法多重RT-PCR检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术目的在于提供一种PEMV

【技术实现步骤摘要】
PEMV
‑
1、BYMV、BrYV一步法多重RT
‑
PCR检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及PEMV
‑
1、BYMV、BrYV一步法多重RT
‑
PCR检测引物组、试剂盒及方法

技术介绍

[0002]豌豆耳突花叶病毒1号（pea enation mosaic virus 1，PEMV
‑
1）归属于耳突花叶病毒属 （Enamovirus）。2019年，专利技术人在云南省豌豆上发现了PEMV
‑
1的侵染，并于2021年首次对PEMV
‑
1在中国的发生进行了报道。近年来，PEMV
‑
1陆续在云南省的多种作物上被检测出来且迅速发展为云南省豌豆上的优势病毒。虽然该病毒未在我国大面积流行，但在云南省豌豆和蚕豆上普遍发生，一旦爆发将会影响作物正常的生长发育，造成严重的损失。菜豆黄花叶病毒（bean yellow mosaic virus，BYMV）为马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。BYMV寄主范围广泛，能侵染大部分的豆科植物，通过种传和蚜虫传播引起植株矮化、叶片褪绿、花叶、皱缩、斑驳等症状，是田间菜豆、豌豆和蚕豆等作物病毒病的主要病原之一。BYMV一直以来都是我国蚕豆上的优势病毒。芸薹黄化病毒（brassica yellows virus，BrYV）是2011年在十字花科作物上发现的病毒，属于马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）。2022年首次发现BrYV能够侵染豆科作物，在云南省等一些省区的豌豆、蚕豆上均发现BrYV的侵染，且病毒扩散能力较强、传播速度快。对2021年和2023年云南省豌豆、蚕豆病毒病发生情况进行了田间调查和病毒检测，发现PEMV
‑
1为云南省豌豆上的优势 病毒，两年的病毒检出率均在50%以上且呈上升趋势，该病毒在蚕豆中的检出率也不断增加；2021年BYMV在云南省蚕豆上的检出率达到80%以上，病毒带来的危害严重；豌豆、蚕豆作为BrYV的新寄主，病毒检出率均在30%以上，传播和扩散速度快。PEMV
‑
1、BYMV、BrYV是当前豌豆和蚕豆生产中检出率较高的三种病毒，且在豌豆、蚕豆上常以复合侵染的形式发生，其中尤以PEMV
‑
1+BYMV、BYMV+BrYV、PEMV
‑
1+BrYV、PEMV
‑
1+BYMV+BrYV复合侵染类型较为常见。由于PEMV
‑
1、BYMV、BrYV可通过蚜虫传播实现病毒间的协生互作致病成灾，三种病毒复合侵染对豌豆、蚕豆等作物的为害严重，损失大。因此，加强对PEMV
‑
1、BYMV、BrYV在作物和传播介体蚜虫中的监测，对于预防和控制PEMV
‑
1、BYMV、BrYV引起的病害显得尤为重要。
[0003]当前常规的RT
‑
PCR方法对PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的检测至少需要进行三次RT
‑
PCR才可完成，检测过程耗时长，检测成本高。建立PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的一步法多重RT
‑
PCR检测体系的难点在于引物组合的浓度设置和退火温度调整。

技术实现思路

[0004]建立PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的一步法多重RT
‑
PCR检测体系，可以将一个样品中含有的三种病毒同时检出，大大缩短检测时间，节约检测成本。另外，将建立的多重检测体系中所涉及到的检测试剂、引物等组装成试剂盒并附具体检测方法，能够规范操作程序，减少操作次数的同时节约检测试剂，避免交叉污染，同时达到操作简便、准确度高、特异性强、适用性好的技术优势。本专利技术申请提供一种PEMV
‑
1、BYMV、BrYV一步法多重RT
‑
PCR检测引物组、试
剂盒及方法，提高PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的检测效率，为PEMV
‑
1、BYMV、BrYV引起的植物病毒病的监测、预防和控制提供技术支撑。
[0005]为实现上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：本专利技术申请第一方面提供了引物组合，包括第一引物组合、第二引物组合和第三引物组合；第一引物组合，具有：(I).上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或第二引物组合，具有：(I).上游引物具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；或第三引物组合，具有：(I).上游引物具有如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。
[0006]本专利技术申请第二方面提供了上述引物组合在制备PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂或试剂盒中的应用。
[0007]本专利技术申请第三方面提供了PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂，包括上述引物组合以及可接受的助剂。
[0008]本专利技术申请第四方面提供了PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂盒，包括上述引物组合以及可接受的辅料、助剂和/或载体。
[0009]本专利技术申请第五方面提供了PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测方法，使用上述引物组合或上述试剂盒对待测样品进行扩增、检测。
[0010]进一步优选，上述引物组合在制备PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂或试剂盒中的应用或上述PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测方法，其检测的体系共10
µ
L，具体包括：2
×
1stepBuffer5.0
µ
LRNaseFreewater1.7
µ
LPrimeScript
®
OneStepEnzymeMix0.4
µ
L第一引物组合的上、下游引物各0.35
µ
L，第二引物组合的上、下游引物各0.3
µ
L，第三引物组合的上、下游引物各0.3
µ
L，待测样品总RNA1.0
µ
L。
[0011]进一步优选，上述引物组合在制备PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂或试剂盒中的应用或上述PEMV
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物组合，其特征在于：包括第一引物组合、第二引物组合和第三引物组合；所述第一引物组合，具有：(I).上游引物具有如SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；或所述第二引物组合，具有：(I).上游引物具有如SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；或所述第三引物组合，具有：(I).上游引物具有如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；和(II).下游引物具有如SEQIDNo.6所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的引物组合在制备PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂或试剂盒中的应用。3.PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物组合以及可接受的助剂。4.PEMV
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1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物组合以及可接受的辅料、助剂和/或载体。5.PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测方法，其特征在于：使用如权利要求1所述的引物组合或如权利要求4所述的试剂盒对待测样品进行扩增、检测。6.如权利要求2所述的引物组合在制备PEMV
‑
1、BYMV、BrYV的多重RT
‑
PCR检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于：检测的体系共10
µ
L，具体包括：2
×
1stepBuffer5.0
µ
LRNaseFreewater1.7
µ
LPrimeScript
®
OneStepE...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡红，余淑婷，李凡，兰平秀，陈小姣，谭冠林，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：