猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测用引物及探针组合、检测方法技术

本发明专利技术根据猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的全基因组序列的保守区段设计了4条特异性引物和2条探针，引物序列为：上游引物PCV2

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测用引物及探针组合、检测方法


[0001]本专利技术涉及一组猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测用引物及探针组合、检测方法，属于分子生物学领域。

技术介绍

[0002]猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是一种呈正二十面体对称的单链环状DNA病毒，也是目前发现的最小的动物病毒。PCV目前有四种血清型，即PCV1、PCV2、PCV3、PCV4，其中PCV1对猪无致病性。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、繁殖障碍、呼吸道疾病综合征及皮炎肾病综合征等。PCV3可引起猪只心脏和多系统炎症、皮炎肾病综合征、仔猪消瘦腹泻及母猪繁殖障碍等。PCV4于2019年在湖南患病猪只中发现并命名，仅在部分省份发现PCV4感染情况。目前，国内外还是以PCV2和PCV3为主，且呈单一或混合感染。因此，若能建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可靠性好的PCV2和PCV3联合检测鉴别方法，对猪圆环病毒的防控及流行病学调查尤为重要。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一组猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测用引物及探针组合。
[0004]本专利技术采用的技术方案为：
[0005]一组猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测用引物及探针组合，包括以下引物：
[0006]上游引物PCV2
‑
F：5
′
－GAGGATTACTTCCTTGGTA－3
′
；
[0007]下游引物PCV2
‑
R：5
′
－GACTCAGTAATTTATTTCATATGG－3
′
；
[0008]上游引物PCV3
‑
F：5
′
－AGGTGGTGTTTTACGATA－3
′
；
[0009]下游引物PCV3
‑
R：5
′
－CCTCTTTGCCGATAATAAG－3
′
；
[0010]以及以下探针：
[0011]PCV2
‑
P：5
′
－FAM
‑
TGCTACAGAACAATCCACGGAGG
‑
BHQ1－3
′
；
[0012]PCV3
‑
P：5
′
－Cy5
‑
TGCCTCCACACTCCACAATAGATT
‑
BHQ2－3
′
。
[0013]本专利技术还公开了一种猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测
[0014]方法，包括以下步骤:
[0015]a、模板DNA的提取：提取待检样品的DNA；
[0016]b、TaqMan qPCR扩增反应：以步骤a提取的DNA为模板，加入上述的引物和探针进行TaqMan qPCR扩增反应；
[0017]c、对TaqMan qPCR扩增反应进行实时荧光检测，根据扩增过程中不同通道的荧光信号进行结果判断，其中FAM通道为PCV2检测结果，Cy5通道为PCV3检测结果，检测通道Ct值≤35且扩增曲线呈S型为阳性；检测结果Ct值＞38或无Ct值为阴性；检测通道35＜Ct值≤
38，且两次检测均能得到S型扩增曲线方判定为阳性。
[0018]优选的，步骤b中的反应体系包括：
[0019]TaqProbe 2X qPCR
‑
Multiplex预混液10μL；
[0020]20μmol/L上游引物PCV2
‑
F、下游引物PCV2
‑
R、上游引物PCV3
‑
F、下游引物PCV3
‑
R各0.8μL；
[0021]20μmol/L PCV2
‑
P、PCV3
‑
P各0.3μL；
[0022]模板2μL；
[0023]RNase
‑
free水4.2μL。
[0024]优选的，步骤b中的反应过程为：95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火与延伸20s，40个循环。
[0025]本专利技术采用双重实时荧光定量PCR检测技术实现对PCV2和PCV3的检测。通过Genbank数据库下载PCV2和PCV3全基因组序列，然后使用clustalx软件查找各基因型保守序列，根据保守序列设计特异性的扩增引物和荧光探针，并借助扩增引物和荧光探针对待检鉴定病毒的DNA模板进行双重实时荧光定量PCR反应，通过对产物实时监测，实现对PCV2和PCV3的快速检测。
[0026]本专利技术的优点有以下几点：
[0027]1、灵敏度高，本专利技术提供的引物和探针具有非常良好的灵敏度，对10copies/μL以上模板量的扩增均能出现典型的扩增曲线。
[0028]2、特异型好，本专利技术提供的引物和探针对于不含有PCV2和PCV3的检测样品均无扩增信号。
[0029]3、操作简便，检测用时短，在1小时内即可完成检测。
[0030]4、结果可靠，本专利技术采用荧光定量PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，仪器自动生成结果，避免了普通PCR检测常出现假阳性结果的现象。
附图说明
[0031]图1是双重实时荧光定量PCR方法检测PCV2的标准曲线。
[0032]图2是双重实时荧光定量PCR方法检测PCV3的标准曲线。
[0033]图3是双重实时荧光定量PCR方法的特异性检测结果；其中，1：PCV2；2：PCV3；C：其他病原核酸(包括CSFV、PRRSV、PRV、FMDV、HPS)，肉眼无法有效区分。
[0034]图4是双重实时荧光定量PCR方法检测PCV2和PCV3混合质粒的敏感性试验结果；其中，1:质粒浓度为1
×
105拷贝/μL；2:质粒浓度为1
×
104拷贝/μL；3:质粒浓度为1
×
103拷贝/μL；4:质粒浓度为1
×
102拷贝/μL；5:质粒浓度为1
×
101拷贝/μL。
[0035]图5是临床样品的荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
[0036]下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但实施例的描述不对本专利技术的保护范围产生任何限制。
[0037]除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描
述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。
[0038]下列实施例中所用的物质或仪器，如果未进行特殊说明的话，均可以从常规的商用渠道获取。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量PCR检测用引物及探针组合，包括以下引物：上游引物PCV2
‑
F：5
′
－GAGGATTACTTCCTTGGTA－3
′
；下游引物PCV2
‑
R：5
′
－GACTCAGTAATTTATTTCATATGG－3
′
；上游引物PCV3
‑
F：5
′
－AGGTGGTGTTTTACGATA－3
′
；下游引物PCV3
‑
R：5
′
－CCTCTTTGCCGATAATAAG－3
′
；及以下探针：PCV2
‑
P：5
′
－FAM
‑
TGCTACAGAACAATCCACGGAGG
‑
BHQ1－3
′
；PCV3
‑
P：5
′
－Cy5
‑
TGCCTCCACACTCCACAATAGATT
‑
BHQ2－3
′
。2.一种猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重实时荧光定量P...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽霞，张庆贺，刘晓露，牛婷婷，项青芸，朱思锋，
申请(专利权)人：安徽洪桥中科基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：