一种利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法及应用，属于猴痘核酸检测领域。该检测试剂包括引物HL

【技术实现步骤摘要】
一种利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及猴痘核酸检测领域，具体涉及一种利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法及应用。

技术介绍

[0002]猴痘(Monkeypox，MPX)是由猴痘病毒(monkeypox virus，MPXV)引起的人畜共患性疾病。MPXV由双链DNA和外膜组成，是痘病毒科(包括牛痘病毒、天花病毒和其他痘病毒)正痘病毒属(OPXV)的成员，主要分为西非群株和刚果盆地群株。除了通过猴子传播外，该病毒还通过冈比亚袋鼠和非洲松鼠等啮齿动物传播。MPXV也能感染人类，但其感染率和死亡率明显低于天花病毒。MPXV主要通过直接接触感染者的体液、患病组织或呼吸道飞沫传播。患者会出现头痛、发热、淋巴结肿大以及类似水疱状皮疹等症状。潜伏期通常为7至14天，症状持续时间2至4周，致死率在0％～11％之间，绝大多数患者可康复。目前还没有针对MPX的针对性治疗方案，因此，准确的检测对于早期发现病例、快速鉴别诊断和控制病毒传播至关重要。
[0003]可以通过病毒分离和培养技术、电子显微镜活检、痘病毒抗原的免疫组织化学染色以及抗正痘病毒IgM和IgG抗体的血清学研究来检测MPXV。然而，上述诊断测试既是不确定的，也需要冗长的培养过程。根据病毒的流行病学特征和监测需要，MPXV感染的确认最适合通过病毒核酸分子扩增，特别是聚合酶链反应(PCR)技术快速检测MPXV DNA。各种诊断标本可直接从皮疹中获得，包括皮肤、水疱体液和结痂。在短时间内对痘病毒可以进行早期筛查诊断。虽然PCR是检测MPXV的金标准，但由于对操作仪器和操作人员的要求较高，在较偏远的地区无法满足上述条件。因此，对于MPXV的早期筛查、诊断和疗效评价，开发一种操作简单、方便高效、灵敏度高、特异性强的检测方法至关重要。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提出了一种利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法及应用。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0006]一种猴痘病毒核酸检测试剂，包括：
[0007]序列为SEQ ID NO.2的引物HL
‑
F；以及
[0008]序列为SEQ ID NO.3的引物HL
‑
R。
[0009]可选地，所述引物HL
‑
F的5
’
端由地高辛修饰，所述引物HL
‑
R的5
’
端由生物素修饰。
[0010]一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，包括；
[0011]上述的试剂；
[0012]解旋酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶；
[0013]反应试剂；以及
[0014]侧流免疫层析试纸。
[0015]可选地，所述侧流免疫层析试纸包括：玻璃纤维样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫与PVC支撑板。
[0016]可选地，所述反应试剂包括缓冲液、dNTPs、硫酸镁与氯化钠。
[0017]非治疗目的的上述的试剂、上述的试剂盒在检测体外样本是否含有猴痘病毒中的应用。
[0018]可选地，所述检测包括以下步骤:
[0019]根据目标DNA设计DNA引物；
[0020]制备反应试剂，进行解旋酶依赖的等温扩增，获得扩增产物；
[0021]将扩增产物滴加到侧向流动试纸条，观察结果。
[0022]可选地，所述反应试剂包括缓冲液、dNTPs、硫酸镁与氯化钠。
[0023]可选地，所述dNTPs的浓度为90μmol/L dNTPs。
[0024]本专利技术的有益效果：
[0025]本专利技术所提供的利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法准确率高、操作简单，所需时间短。与PCR不同，由于本专利技术无需反复退火，只需水浴锅就可进行反应，操作简单，对仪器和人员的要求较少，用肉眼就可以观察到反应结果，可适用于大规模的筛查和即时检测。可满足未配备PCR仪器的基层医院进行快速检测。
附图说明
[0026]下面结合附图对本专利技术作进一步的说明。
[0027]图1为利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法示意图。图1A表示解旋酶依赖的等温扩增反应的具体步骤；图1B表示免疫分析试纸条检测Dig和Bio双修饰的扩增产物的原理。免疫层析试纸条由玻璃纤维样品垫、结合垫、NC膜、吸收垫、PVC支撑板组成。将链霉亲和素标记微球喷涂到结合垫上。NC膜T线喷涂抗地高辛鼠单抗，C线喷涂生物素
‑
BSA。
[0028]图2为实施例1中琼脂糖凝胶电泳和侧流免疫层析技术验证解旋酶依赖的等温扩增反应用于检测猴痘病毒核酸的反应条件优化结果。图2a为反应时间的优化图，从左至右分别为35min
‑
75min梯度以及阴性对照结果。图2b为反应温度的优化图，从左至右分别为45℃
‑
65℃梯度以及阴性对照结果。图2c为引物浓度优化图，从左至右分别为2μM
‑
12μM梯度以及阴性对照结果。图2d为dNTPs浓度优化图，从左至右分别为50μmol/L
‑
130μmol/L梯度以及阴性对照结果。检测结果显示添加90μmol/L dNTPs和引物HL
‑
F、HL
‑
R各8μM，在55℃条件下反应65mi时反应效果最佳，且LFT结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。
[0029]图3为实施例2中利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法的灵敏度分析结果。从左至右依次为1.0
×
107copy/mL到1.0
×
101copy/mL的梯度范围以及阴性对照。检测结果显示最低检测限＞10copies/μL，且LFT结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。
[0030]图4为实施例3中利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法检测猴痘病毒核酸检测方法的特异性分析结果。从左至右依次为猴痘假病毒(MPX PV)、牛痘假病毒(CPX PV)、单纯疱疹病毒(HS PV)、水痘假病毒(VZ PV)、巨细胞假病毒(HCM PV)及阴性对照。检测
结果显示扩增结果均未观察到除存在靶标假病毒外的产物，且LFT结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致。
具体实施方式
[0031]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0032]实施例1利用解旋酶依赖的等温扩增联合侧流免疫层析法的猴痘病毒核酸检测方法反应条件的优化
[0033]本实施例根据已公开的猴痘病毒序列进行多序列比对，筛选出F3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猴痘病毒核酸检测试剂，包括：序列为SEQ ID NO.2的引物HL
‑
F；以及序列为SEQ ID NO.3的引物HL
‑
R。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述引物HL
‑
F的5
’
端由地高辛修饰，所述引物HL
‑
R的5
’
端由生物素修饰。3.一种猴痘病毒核酸检测试剂盒，包括；权利要求1或2所述的试剂；解旋酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶；反应试剂；以及侧流免疫层析试纸。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述侧流免疫层析试纸包括：玻璃纤维样品垫、结...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴国球，范小波，古丽乃扎尔，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：