本发明专利技术公开了一种双酶发酵的大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法。本发明专利技术通过对发酵培养基、补料培养基成分的改进(发酵培养基中添加甘氨酸和甲硫氨酸，可减轻葡萄糖代谢产生的乙酸对产双酶菌株的抑制作用；诱导补料成分中添加亮氨酸和脯氨酸，可调节产双酶菌体的生长和两种重组蛋白表达)，结合预诱导阶段和诱导阶段这2个阶段的降温操作和IPTG添加操作，尽量降低对产双酶菌体生长的抑制作用和菌体在产酶过程中的产酶负担。该高密度发酵方法一方面可通过一次发酵获得两种粗酶液，从而减少操作步骤；另一方面，该方法具有发酵配方简单、发酵方法易操作、发酵成本低、发酵菌体产量高、发酵稳定性好的优势。稳定性好的优势。稳定性好的优势。
【技术实现步骤摘要】
一种双酶发酵的大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法
[0001]本专利技术属于发酵工程
，具体涉及一种双酶发酵的大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法。
技术介绍
[0002]大肠杆菌结构简单，发酵周期短，且遗传背景较为清晰，常被用于宿主菌表达重组蛋白。为实现目的产物的大量生产，一方面需要利用分子生物学技术使外源基因成功表达；另一方面，则必须实现重组菌的高密度发酵。高密度发酵可提高菌体的发酵密度进而大幅度提高产量，降低生产成本。
[0003]目前，对于重组大肠杆菌的研究多集中于目的酶的改造和表达。另外，在重组大肠杆菌表达单个酶的高密度发酵培养基及发酵方法(参见CN 111073836 A大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法)，以及大肠杆菌工程菌的普适性培养基(参见CN 114045251 B基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺)方面也有研究。如CN 111073836 A的发酵培养基组分为：酵母提取物10
‑
12g/L，还含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化铵、柠檬酸钠、葡萄糖和七水硫酸镁。补料培养基
①
为：葡萄糖400
‑
500g/L、硫酸镁10
‑
12g/L和微量元素溶液2mL/L；补料培养基
②
为：240g/L酵母提取物溶液。CN 114045251 B公开的高密度发酵培养基，包括基础培养基(包含微量元素在内共25种组分)、C源补料培养基(包含4种组分)、诱导补料培养基(包含8种组分，其中酵母提取物100
‑
120g/L，胰蛋白胨100
‑
120g/L)；上述专利中的高密度发酵培养基存在发酵成分复杂、补料氮源含量高、微量元素不好配置等问题。
[0004]另外，筛选适合双酶发酵的大肠杆菌高密度发酵培养基方面的研究相对较少，如CN 111662942A公开了一种基因工程大肠杆菌高密度发酵培养基及其发酵工艺，其发酵培养基为：磷酸二氢钾2～10g/L、磷酸氢二铵1～10g/L、柠檬酸0.5～9g/L、酵母粉2～20g/L、葡萄糖5～50g/L、微量元素母液1～20g/L，pH为6.6～8.5。该专利同样使用多种微量元素。双酶的高密度发酵本身一方面要实现菌体的高密度发酵，另一方面需要启动两种酶的表达。外源蛋白表达时常常消耗大量的宿主细胞资源，对宿主细胞造成代谢负荷，影响宿主的生化和生理，甚至损害宿主正常的代谢功能和细胞的生存，这种变化又会影响到重组蛋白的合成速率、蛋白质的稳定性、正确折叠，以及下游的分离纯化，对改造的大肠杆菌基因工程菌的生长和产酶能力的负面影响都较大。因此筛选一种既适合大肠杆菌菌体生长又能有利于提高酶活的培养基十分必要。
技术实现思路
[0005]针对上述问题，本专利技术提供了一种双酶发酵的大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法。本专利技术通过对发酵培养基、补料培养基成分的改进，结合预诱导阶段和诱导阶段这2个阶段的降温操作和IPTG添加操作，尽量降低对产双酶菌体生长的抑制作用和菌体在产酶过程中的产酶负担。该高密度发酵方法一方面可通过一次发酵获得两种粗酶液，从而减少操
作步骤；另一方面，该方法具有发酵配方简单、发酵方法易操作、发酵成本低、发酵菌体产量高、发酵稳定性好的优势。
[0006]本专利技术的技术方案是：一种双酶发酵的大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法，其特征是，采用分批补料高密度发酵方式，具体步骤如下：
[0007](1)菌体高密度发酵阶段：
[0008]将重组双酶发酵的大肠杆菌工程菌的二级种子液按照体积比5～10％接种量接种于发酵培养基进行高密度发酵，生长过程控制溶氧值在30～40％，培养温度为30～37℃，发酵pH为6.5～7.0，培养时间为20～28h；溶氧瞬间反弹点为补料点，此时选择补料1进行补料操作；
[0009](2)菌体产酶阶段：
[0010]预诱导阶段：在发酵过程中菌体浓度OD
600
＝40～50时，分2个阶段降温，菌体浓度每增加3～5个OD时，降温一次，最终降低培养温度为25～28℃；
[0011]诱导阶段：控制溶氧值在20～30％，培养温度为30～37℃，pH为6.8～7.2；当菌体浓度到达诱导点时，选择诱导补料2进行补料；分2个批次加入诱导剂异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)，菌体浓度每增加3～5个OD时，添加诱导剂一次，最终诱导剂的浓度为0.2～0.5mM。
[0012]所述高密度发酵培养基的组成为：7～9g/L酵母浸粉、10～14g/L蛋白胨、7.2～10.0g/L葡萄糖
·
H2O、2.5～5.0g/L的(NH4)2SO4、3.5～5.5g/L的K2HPO4·
3H2O、2.5～4.0g/L NaCl、1.5～3.0g/L柠檬酸
·
H2O、0.2～1.0g/L柠檬酸铁铵、0.5～1.0g/L的MgSO4·
7H2O、0.2～1.0g/L甘氨酸、0.2～1.0g/L的甲硫氨酸。
[0013]所述补料1的组成为：30～37g/L的酵母粉、10～20g/L的蛋白胨、450～500g/L的葡萄糖
·
H2O。
[0014]所述诱导补料2的组成为：40～50g/L的酵母粉、20～27g/L的蛋白胨、450～500g/L的葡萄糖
·
H2O、1～3g/L亮氨酸、1～3g/L的脯氨酸。
[0015]所述步骤(1)菌体高密度发酵条件为：溶氧值为30～40％，氨水根据pH反馈补料控制发酵培养基的pH值为6.5～7.0，罐压为0.03～0.08Mpa。
[0016]进一步的，上述二级种子液的制备方法为：
[0017]一级种子液制备：将重组双酶发酵的大肠杆菌工程菌的甘油菌以0.03～0.05％的接种量接种于一级种子培养基中，在35～37℃下摇床培养8～12h；
[0018]二级种子液(摇瓶种子培养二级种子)制备：将上述一级种子液按照体积比为1～5％的接种量接种到二级种子培养基中，在35～37℃下摇床培养4～5h，至对数生长期结束。
[0019]二级种子液(种子罐培养二级种子)制备：将上述一级种子培养液按照体积比为1～5％的接种量接种至二级种子培养基中种子罐中培养，控制发酵培养基溶氧值在25～35％，培养温度为33～37℃，发酵pH为6.5～7.0，罐压为0.03～0.05Mpa，培养时长为4～6h至对数生长期结束。
[0020]上述一级种子培养基的组成为：9.0～10.0g/L酵母浸粉、14.0～15.0g/L蛋白胨、7.2～10.0g/L葡萄糖
·
H2O、2.5～5.0g/L(NH4)2SO4、3.5～5.5g/L K2HPO4·
3H2O、1.5～3.0g/L柠檬酸
·
H2O、0.2～1.0g/L柠檬酸铁铵。硫酸卡那霉素浓度为50～100mg/L。
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种双酶发酵的大肠杆菌工程菌的高密度发酵方法，其特征是，采用分批补料高密度发酵方式，具体步骤如下：(1)菌体高密度发酵阶段：将重组双酶发酵的大肠杆菌工程菌的二级种子液按照体积比5～10％接种量接种于发酵培养基进行高密度发酵，培养温度为30～37℃，发酵pH为6.5～7.0，培养时间为20～28h；溶氧瞬间反弹点为补料点，此时选择补料1进行补料操作；(2)菌体产酶阶段：预诱导阶段：在发酵过程中菌体浓度OD
600
＝40～50时，分2个阶段降温，菌体浓度每增加3～5个OD时，降温一次，最终降低培养温度为25～28℃；诱导阶段：控制溶氧值在20～30％，培养温度为30～37℃，pH为6.8～7.2；当菌体浓度到达诱导点时，选择诱导补料2进行补料；分2个批次加入诱导剂异丙基
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β
‑
D
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硫代半乳糖苷，菌体浓度每增加3～5个OD时，添加诱导剂一次，最终诱导剂的浓度为0.2～0.5mM；所述高密度发酵培养基的组成为：7～9g/L酵母浸粉、10～14g/L蛋白胨、7.2～10.0g/L葡萄糖
·
H2O、2.5～5.0g/L的(NH4)2SO4、3.5～5.5g/L的K2HPO4·
3H2O、2.5～4.0g/L NaCl、1.5～3.0g/L柠檬酸
·
H2O、0.2～1.0g/L柠檬酸铁铵、0.5～1.0g/L的MgSO4·
7H2O、0.2～1.0g/L甘氨酸、0.2～1.0g/L的甲硫氨酸；所述补料1的组成为：30～37g/L的酵母粉、10～20g/L的蛋白胨、450～500g/L的葡萄糖
·
H2O；所述诱导补料2的组成为：40～50g/L的酵母粉、20～27g/L的蛋白胨、450～500g/L的葡萄糖
·
H2O、1～3g/L亮氨酸、1～3g/L的脯氨酸。2.如权利要求1所述的高密度发酵方法，其特征是，所述上述二级种子液的制备方法为：所述一级种子液制备为：将重组双酶发酵的大肠杆菌工程菌的甘油菌以0.03～0.05％的接种量接种于一级种子培养基中，在35～37℃下摇床培养8～12h，得到一级种子液；所述二级种...
【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，祁玉清，刘灿珍，尹兵，高志国，
申请(专利权)人：山东天铭医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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