一种大规模质粒生产的发酵工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种大规模质粒生产的发酵工艺，涉及微生物发酵技术领域。该发酵工艺采用一种发酵培养基进行，该发酵培养基包括基础培养基和补料培养基；该基础培养基包括胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、甘油、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、七水硫酸镁和消泡剂；该补料培养基包括胰蛋白胨、酵母粉、甘油、七水硫酸镁、脯氨酸、亮氨酸和消泡剂。本发明专利技术基于现有发酵培养基开发了一种新的发酵培养基，利用该培养基进行质粒菌种发酵培养，可以满足高密度发酵的要求，提高质粒的产量，进而提高质粒生产的产能，降低生产成本。产成本。产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种大规模质粒生产的发酵工艺


[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，特别是涉及一种大规模质粒生产的发酵工艺。

技术介绍

[0002]近些年来，随着生物制品的不断发展，DNA质粒产品，包括DNA疫苗、病毒载体等，不断地应用于新的基因疗法。大肠杆菌发酵获取DNA质粒是常用技术。因此大规模发酵生产高纯度和高质量DNA质粒的技术变得愈发重要。然而培养过程中会出现质粒突变或丢失现象，从而影响质粒产量，增加生产成本。质粒突变是指在培养重组菌过程DNA质粒发生突变，失去原有表型特征。质粒丢失主要原因是细胞在分裂时，由于微生物生长快，质粒在子代细胞中得不到均匀分配，部分子细胞不含质粒。质粒突变与丢失常出现于以下情况，一、数次传代质粒出现突变与丢失；二、在长时间发酵培养过程中。重组基因工程菌大规模发酵DNA质粒，易受培养温度、pH、转速、DO、补料速度及培养基组成等影响。现有发酵工艺未针对慢病毒VSVG/RD114/REV/PMDLG用质粒进行多参数的工艺开发，结果导致质粒产量不高。通过现有DNA质粒发酵工艺生产，仍面临上述DNA质粒产量不够的问题。目前的工艺方法已无法满足经济化和规模化的要求，因此有必要进行新工艺方法的开发及优化。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种大规模质粒生产的发酵工艺，以解决上述现有技术存在的问题，利用本专利技术提供的发酵培养基进行质粒菌种发酵培养，可以满足高密度发酵的要求，提高质粒的产量；将该发酵培养基与优化的发酵工艺相结合，可以进一步提高质粒的产量，从而可以有效提高质粒生产的产能，降低生产成本。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：本专利技术提供一种大规模质粒生产的发酵培养基，包括基础培养基和补料培养基；所述基础培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨8.0
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12.0g/L、酵母粉4.0
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6.0g/L、氯化钠9.0
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11.0g/L、甘油12.0
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13.0g/L、磷酸二氢钾1.2
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2.0g/L、磷酸氢二钾2.0
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2.5g/L、七水硫酸镁0.2
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0.3g/L和消泡剂1.5
‑
2.5mL/L；所述补料培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨70.0
‑
72.0g/L、酵母粉70.0
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72.0g/L、甘油168.0
‑
172.0g/L、七水硫酸镁1.5
‑
2.5g/L、脯氨酸0.6
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1.0g/L、亮氨酸0.6
‑
1.0g/L和消泡剂0.8
‑
1.2mL/L。
[0005]优选地，所述基础培养基包括胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、甘油12.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾2.3g/L、七水硫酸镁0.25g/L和消泡剂2.0mL/L；所述补料培养基包括胰蛋白胨71.0g/L、酵母粉71.0g/L、甘油170.0g/L、七水硫酸镁1.99g/L、脯氨酸0.83g/L、亮氨酸0.83g/L和消泡剂1.0mL/L。
[0006]进一步地，所述消泡剂为Antifoam204。
[0007]本专利技术还提供上述的发酵培养基在大规模质粒生产中的应用。
[0008]进一步地，所述大规模质粒生产使用的含有目的质粒的基因工程菌株为大肠杆菌重组菌株，所述目的质粒为含有VSVG、RD114、REV或PMDLG基因的重组质粒。
[0009]本专利技术还提供一种大规模质粒生产的发酵工艺，包括利用上述的发酵培养基对含有目的质粒的基因工程菌株进行发酵培养的步骤。
[0010]进一步地，所述基因工程菌株为大肠杆菌重组菌株，所述目的质粒为含有VSVG、RD114、REV或PMDLG基因的重组质粒。
[0011]进一步地，所述发酵培养包括：将所述基因工程菌株接种于所述发酵培养基的基础培养基中，培养5h后，按照以下公式所示的补料速率F进行指数补料发酵：，其中，μ：菌比生长速率，V0：补料开始罐内培养基体积；ρ
Co
：开始补料时罐内菌体质量浓度；Y
X/s
：菌体得率；ρ
sF
：补料培养基的总糖质量浓度；ρ
s
：开始补料时段的罐内总糖质量浓度；t：指数补料时间。
[0012]进一步地，所述发酵培养的温度控制条件为：0~21h 33℃，21~24h 35℃，24~30h 42℃。
[0013]进一步地，所述发酵培养的pH为7.0；所述发酵培养在17h后，溶氧控制在30%。
[0014]本专利技术公开了以下技术效果：本专利技术基于现有发酵培养基及发酵工艺，针对质粒菌种的发酵工艺进行优化，形成了一种新的发酵培养基及其配套发酵工艺。该发酵培养基包括基础培养基和补料培养基，利用该发酵培养基进行质粒菌种发酵培养，可以满足高密度发酵的要求，提高质粒的产量。同时，本专利技术进一步还对发酵工艺进行了优化，具体是在前期利用基础发酵培养基发酵一定时间后，利用优化的补料培养基以限制的比生长速率进行指数补料发酵，并优化发酵温度控制参数，以进一步提高质粒的产量。利用本专利技术的培养基及其配套发酵工艺进行质粒菌种发酵生产，质粒产量可达400~716mg/L，从而可以有效提高质粒生产的产能，降低生产成本。
附图说明
[0015]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]图1为实施例1中RD114重组菌株0
‑
28h的发酵生长和质粒增长曲线。
具体实施方式
[0017]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0018]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的
中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0019]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0020]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大规模质粒生产的发酵培养基，其特征在于，包括基础培养基和补料培养基；所述基础培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨8.0
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12.0g/L、酵母粉4.0
‑
6.0g/L、氯化钠9.0
‑
11.0g/L、甘油12.0
‑
13.0g/L、磷酸二氢钾1.2
‑
2.0g/L、磷酸氢二钾2.0
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2.5g/L、七水硫酸镁0.2
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0.3g/L和消泡剂1.5
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2.5mL/L；所述补料培养基包括以下各含量的组分：胰蛋白胨70.0
‑
72.0g/L、酵母粉70.0
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72.0g/L、甘油168.0
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172.0g/L、七水硫酸镁1.5
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2.5g/L、脯氨酸0.6
‑
1.0g/L、亮氨酸0.6
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1.0g/L和消泡剂0.8
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1.2mL/L。2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述基础培养基包括胰蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L、甘油12.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾2.3g/L、七水硫酸镁0.25g/L和消泡剂2.0mL/L；所述补料培养基包括胰蛋白胨71.0g/L、酵母粉71.0g/L、甘油170.0g/L、七水硫酸镁1.99g/L、脯氨酸0.83g/L、亮氨酸0.83g/L和消泡剂1.0mL/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘红，侯国栋，刘国庆，胡国健，李蓓蓓，张盼，
申请(专利权)人：赛奥斯博生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：