一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程及生物工程技术领域。本发明专利技术通过在大肠杆菌中敲除编码莽草酸脱氢酶的基因aroE和3个编码醛酮还原酶AKRs的基因dkgA、dkgB和yeaE，3个编码乙醇脱氢酶ADHs的基因yqhD、yahK和yjgB，并异源表达脱氢莽草酸脱水酶DSD、甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR，获得能够合成香兰素的重组大肠杆菌K2。所述重组大肠杆菌能够通过基于廉价小分子葡萄糖作为前体合成香兰素，在化妆品、纺织品、食品领域具有重要作用。品领域具有重要作用。品领域具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及一种合成香兰素的重组大肠杆菌及其应用，属于基因工程及生物工程


技术介绍

[0002]香兰素也叫香草醛、甲基原儿茶醛，化学名称为4
‑
羟基
‑3‑
甲氧基苯甲醛(4
‑
hydroxy
‑3‑
methoxybenzaldehyde)，是全球使用最广泛的香料之一。香兰素主要从芸香科植物香荚兰豆(Vanilla planifolia)中提取，具有抗氧化、抗菌、抗炎等效果，广泛应用于食品、化妆品和医药领域，另外，香兰素也被应用于农药行业。目前，市场上的香兰素主要来源于化学合成，其市场份额占比达90％，与植物提取香兰素(2018年6月为515美元/千克)相比，化学合成香兰素的生产成本更低(约12美元/千克)。然而，化学合成香兰素香型较为单一，缺乏天然香兰素的复合香气，且无法应用于食品领域。随着食品与化妆品领域对天然香兰素的需求日益增加，亟需开发合成天然香兰素的其他途径。
[0003]生物合成香兰素主要通过植物合成、酶催化与微生物合成实现。植物合成方式是在植物组织细胞中进行香兰素的合成，基于大部分植物中已经存在的香兰素合成途径，对其关键基因进行强化即可实现香兰素的积累，其主要限制因素为香兰素产量偏低和植物生长周期较长。酶催化合成香兰素主要利用香兰素形成过程中的关键酶，通过添加前体的方式催化获得香兰素。微生物合成香兰素则利用了真菌、细菌、酵母与基因工程重组菌进行香兰素的合成，根据所用菌株的特性可以将不同来源的底物转化为香兰素，甚至包括富含阿魏酸、木质素、葡萄糖等的农副产品。微生物利用农副产品生产香兰素已成为热门，对农副产品的利用使得可持续发展成为可能。同时，衍生出来的还有微生物从头合成的新思路，即以葡萄糖、氨基酸等广泛存在且廉价的易得的小分子物质为底物，通过重构微生物的代谢网络，使整个微生物服务于目标产物的合成，从而获得的产物成本低、安全性高，也能更好地被应用于食品、医药等领域。
[0004]大肠杆菌是合成各类化合物的常用微生物细胞工厂，属于革兰氏阴性兼性厌氧菌，具有生长周期短，易培养、遗传背景简单且清晰等特点，其代谢途径可塑性强，在过去的报导中已被广泛深入地研究。相比谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母，采用大肠杆菌进行香兰素的生物合成具有操作工艺简单、周期短和成本低廉等优势。在欧盟立法(European legislation(EC Directives88/838))将活细胞或其成分(包括酶)以生物合成形式获得的产物纳入“天然产物(natural products)”一类后，以大肠杆菌为宿主的酶催化合成香兰素成为生物合成香兰素的主要获取途径。但是，现有技术中大肠杆菌以从头合成香兰素的效率不高，限制了其工业化应用的潜力。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术旨在提高大肠杆菌的香兰素合成效率，以期通过更短的发酵周期实现香兰素的高效合成。
[0006]本专利技术提供了一种合成香兰素的重组大肠杆菌，表达了来源于柄孢壳菌(Podospora pauciseta)的脱氢莽草酸脱水酶DSD、来源于钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的甲氧基转移酶LiOMT和来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的羧酸还原酶NiCAR，并敲除了莽草酸脱氢酶基因aroE，醛酮还原酶AKRs基因dkgA、dkgB、yeaE，乙醇脱氢酶ADHs基因yqhD、yahK、yjgB中的一个或多个基因。
[0007]在一种实施方式中，所述脱氢莽草酸脱水酶DSD具有NCBI登录号：CAD60599所示的氨基酸序列，编码DSD的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]在一种实施方式中，所述甲氧基转移酶LiOMT具有NCBI登录号：NC_004342.2所示的氨基酸序列，编码LiOMT的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]在一种实施方式中，所述羧酸还原酶NiCAR具有NCBI登录号：AY495697所示的氨基酸序列，编码NiCAR的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]在一种实施方式中，重组大肠杆菌工程菌敲除了编码莽草酸脱氢酶的基因aroE(Gene ID:947776)，敲除了3个编码醛酮还原酶AKRs的基因dkgA(Gene ID:947495)、dkgB(Gene ID:944901)和yeaE(Gene ID:946302)，并敲除了3个编码乙醇脱氢酶ADHs的基因yqhD(Gene ID:947493)、yahK(Gene ID:944975)和yjgB(Gene ID:948802)。
[0011]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌K
‑
12MG1655为出发菌株。
[0012]在一种实施方式中，表达载体pETDuet
‑
1的P
T7
启动子被替换为组成型启动子P
rpsU
。
[0013]在一种实施方式中，表达载体pCDM4的P
T7
启动子被替换为P
trc
启动子。
[0014]在一种实施方式中，以pETDuet
‑
1为表达载体表达所述脱氢莽草酸脱水酶DSD。
[0015]在一种实施方式中，以pCDM4为表达载体表达所述甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR。
[0016]在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以表达载体pETDuet
‑
1表达脱氢莽草酸脱水酶DSD，并以表达载体pCDM4表达甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR。
[0017]本专利技术还提供了一种生产香兰素的方法，以所述重组大肠杆菌为发酵菌株，以葡萄糖为底物，发酵生产香兰素。
[0018]在一种实施方式中，用于发酵的培养基含有：葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、柠檬酸、CaCl2、FeSO4、维生素B1、胰蛋白胨、酵母粉、Al2(SO4)3、CoSO4、CuSO4、H3BO3、MnSO4、Na2MoO4、NiSO4、ZnSO4。
[0019]在一种实施方式中，发酵至少20小时。
[0020]在一种实施方式中，所述发酵是将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中培养至OD
600
＝0.8～1.0后，将温度控制在30℃，添加异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。
[0021]在一种实施方式中，所述诱导是用终浓度为0.4～0.6mM IPTG诱导16～24h。
[0022]在一种实施方式中，所述诱导是用终浓度为0.4～0.6mM IPTG诱导20h。
[0023]本专利技术还保护所述重组菌，或生产香兰素的方法，或利用大肠杆菌合成香兰素的方法在制备含有香兰素的产品中的应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种合成香兰素的重组大肠杆菌，其特征在于，表达了来源于柄孢壳菌(Podospora pauciseta)的脱氢莽草酸脱水酶DSD、来源于钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的甲氧基转移酶LiOMT和来源于诺卡氏菌(Nocardia iowensis)的羧酸还原酶NiCAR，并敲除了莽草酸脱氢酶基因aroE，醛酮还原酶AKRs基因dkgA、dkgB、yeaE，乙醇脱氢酶ADHs基因yqhD、yahK、yjgB中的一个或多个基因。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pETDuet
‑
1为表达载体表达所述脱氢莽草酸脱水酶DSD。3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pCDM4为表达载体表达所述甲氧基转移酶LiOMT和羧酸还原酶NiCAR。4.根据权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，表达载体pETDuet
‑
1的P
T7
启动子被替换为组成型启动子P
rpsU
。5.根据权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，乌仁嘎，曾伟主，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：