一株温控高产莽草酸的重组大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株温控高产莽草酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明专利技术涉及微生物领域，具体涉及一株温控高产莽草酸的重组大肠杆菌及其应用。本发明专利技术提供的重组大肠杆菌，含有aroF

【技术实现步骤摘要】
一株温控高产莽草酸的重组大肠杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物领域，具体涉及一株温控高产莽草酸的重组大肠杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]莽草酸(Shikimic acid,Shikimate)为白色结晶粉末，易溶于水，气味辛酸，广泛存在于细菌和植物的莽草酸代谢途径中。莽草酸是合成芳香族氨基酸的关键前体，还可以用于合成生物碱、吲哚衍生物和手性药物等，研究表明莽草酸及其衍生物具有抗病毒、抗癌、抗炎、镇痛及抑制血栓形成等药理作用。自2003年，以莽草酸为核心原料合成的磷酸奥司他韦“达菲”来，莽草酸引起各国极大关注，“达菲”是多种季节性流感病毒、禽流感病毒H5N1和人类流感病毒H1N1神经氨酸酶的有效抑制剂，随着禽流感形势日趋严峻，世界各国对“达菲”的需求量急剧上升。因此，对莽草酸生物合成途径、莽草酸代谢调控和规模化生产应用的研究越来越受到人们的重视。
[0003]目前，国内外莽草酸的生产方法主要有植物提取法、化学合成法和微生物发酵法等。莽草酸大量存在于木兰科植物八角茴香的种子中，从八角中通过植物提取的方法制备莽草酸是现在工业化生产莽草酸的主要方式，但是受限于原料来源不稳定、土地资源限制等因素，导致莽草酸产能不足，无法大量生产；化学法合成莽草酸，受限于工艺复杂、环境污染大、底物成本高，也不能大规模应用于莽草酸生产；而采用微生物发酵法生产莽草酸因其环保、成本低廉、产量不受原料来源限制、容易工业化持续生产，开发微生物发酵法工业化生产莽草酸是主要趋势。
[0004]微生物发酵法生产莽草酸在国内外已有相关报道，产莽草酸的菌种主要是通过对其莽草酸代谢途径的相关基因进行代谢路线改造。目前，国内外已通过一些大肠杆菌、枯草杆菌或谷氨酸棒杆菌生产莽草酸的相关专利，但大都是小试水平，未见大规模生产的技术应用报道，虽然罗氏公司已报道发酵法生产莽草酸的方法，但是从其生产成本角度考虑，其生产“达菲”所用的莽草酸原料主要还是依赖于中国种植的八角属植物提取。
[0005]在微生物发酵工业化生产莽草酸的菌种构建过程中，还存在莽草酸代谢途径上底物反馈抑制，多基因表达水平比例失调增加菌株的代谢负担；原料诱导表达系统引入，需要添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)等诱导剂，造成莽草酸的发酵生产成本高和工艺控制复杂等因素。因此，要实现微生物发酵工业化生产莽草酸，就急需获得适用于规模化生产的高产莽草酸菌株。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的主要问题是如何改善莽草酸工业化生产上产量不足、工艺复杂和转化率偏低的问题，实现微生物发酵工业化生产莽草酸。
[0007]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种重组大肠杆菌。
[0008]本专利技术提供的重组大肠杆菌含有aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因
簇，所述aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇是编码3
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脱氧
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D
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阿拉伯庚酮糖酸7
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磷酸合成酶的aroF
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突变基因、编码3
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脱氢奎宁酸合成酶的aroB突变基因、编码莽草酸脱氢酶的aroE突变基因和编码转醛酶的talA突变基因。
[0009]所述aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇的核苷酸序列是序列1，其中序列1的第9
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1079位是aroF
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突变基因，第1088
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2420位是aroB突变基因，第2673
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3491位是aroE突变基因，第3736
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4686位是talA突变基因，前文所述重组大肠杆菌敲除CsrA基因，所述CsrA基因编码氨基酸序列是序列6的贮碳因子A蛋白。
[0010]前文所述的重组大肠杆菌中，所述aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇中含有启动子pRpL启动子，所述pRpL启动子位于蛋白质aroB编码基因的上游、所述pRpL启动子位于aroE编码基因的上游，所述pRpL启动子位于talA编码基因的上游。所述pRpL启动子可为下述任一种DNA分子:
[0011]1)一条链的核苷酸序列为序列表中序列2；
[0012]2)与1)的DNA分子具有80％以上同一性且具有启动子功能的DNA分子。
[0013]所述aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇中，所述pRpL启动子驱动所述基因aroB、aroE和talA的转录。
[0014]进一步地，前文所述重组大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)HYY1458，其在中国典型培养物保藏中心的登记入册编号为CCTCC NO：M 20222026。
[0015]前文所述的重组大肠杆菌中，所述3
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脱氧
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D
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阿拉伯庚酮糖酸
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磷酸合成酶(aroF
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)是氨基酸序列是序列7的蛋白质。
[0016]前文所述的重组大肠杆菌中，所述3
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脱氢奎宁酸合成酶(aroB)是氨基酸序列是序列8的蛋白质。
[0017]前文所述的重组大肠杆菌中，所述莽草酸脱氢酶(aroE)是氨基酸序列是序列9的蛋白质。
[0018]前文所述的重组大肠杆菌中，所述转醛酶(talA)是氨基酸序列是序列10的蛋白质。
[0019]所述重组大肠杆菌按照如下方法构建。
[0020]本专利技术提供了一种构建重组大肠杆菌的方法。
[0021]本专利技术提供的构建重组大肠杆菌的方法包括敲除受体大肠杆菌中前文所述的贮碳因子CsrA基因，将前文所述的aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇导入所述受体大肠杆菌，得到重组大肠杆菌。
[0022]所述受体大肠杆菌可为大肠杆菌CGSC 8556。
[0023]所述受体大肠杆菌可为敲除贮碳因子A蛋白的编码基因的重组大肠杆菌CGSC 8556。
[0024]本专利技术还提供了一种生产莽草酸的方法，包括培养前文所述重组大肠杆菌，得到发酵产物，从所述发酵产物中得到莽草酸。
[0025]在一种具体实施例中，采用大肠杆菌HYY1458温控发酵生产莽草酸，可包括以下步骤：
[0026]步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌含有aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇，所述aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇含有编码3
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脱氧
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阿拉伯庚酮糖酸7
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磷酸合成酶的aroF
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突变基因、编码3
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脱氢奎宁酸合成酶aroB突变基因、编码莽草酸脱氢酶的aroE突变和编码转醛酶的talA突变基因；所述aroF
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pRpLaroB
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pRpLaroE
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pRpLtalA突变基因簇的核苷酸序列是序列1，其中序列1的第9
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1079位是aroF
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突变基因，第1088
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2420位是aroB突变基因，第2673
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3491位是aroE突变基因，第3736
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4686位是talA突变基因；序列1上第224位的A突变成C，626位的G突变成A，1633位的C突变成A，1867位的C突变成G，2369位的C突变成A，3134的C突变成G，4179位的A突变成G。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌不含有碳存储调控因子A基因，所述碳存储调控因子A基因编码氨基酸序列是序列6的蛋白质。3.根据权利要求1
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3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于：aroF
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pRpLaroB
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄建忠，吴伟斌，黄忠平，丁菊凤，
申请(专利权)人：福建亿懿兴华生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：