改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产缬氨酸的应用制造技术

本发明专利技术公开了改造的克雷伯氏属细菌及其生产缬氨酸的应用。该方法改造的克雷伯氏属细菌为α

【技术实现步骤摘要】
改造的克雷伯氏菌属细菌及其生产缬氨酸的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及改造的克雷伯氏属细菌及其生产缬氨酸的应用。

技术介绍

[0002]缬氨酸，是一种支链氨基酸，作为营养强化剂用于动物饲料、食品、药品和化妆品等领域。缬氨酸是一种含有五个碳原子的支链非极性的a
‑
氨基酸。缬氨酸是一种白色结晶粉末，具有较强的亲水性。在生产路线上，主要包括化学合成法和微生物发酵法。化学合成法利用异丁醛与氨生成氨基异丁醇，再与氰化氢合成氨基异丁腈，进一步水解得到缬氨酸。化学法使用到有毒原料，同时有多种副产物合成，逐渐被淘汰。目前工业上生产缬氨酸主要是生物法，使用的生产菌株包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，大肠杆菌(Escherichia coli)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，酿酒酵母(Sac charomyces cerevisiae)等。
[0003]缬氨酸生物合成路径包括以下几个步骤。第一个步骤是通过糖酵解途径产生丙酮酸，丙酮酸是细胞代谢的中心代谢产物，是多个合成途径的起始原料。第二步是丙酮酸经α
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乙酰乳酸合成酶催化形成乙酰乳酸。第三步是乙酰乳酸经酮酸还原异构酶催化形成2,3
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二羟基异戊酸。第四步是2,3
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二羟基异戊酸经二羟酸脱水酶催化形成2
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酮异戊酸。第五步是2
‑
酮异戊酸经转氨酶催化生成缬氨酸。
[0004]克雷伯氏属细菌(genus Klebsiella)是一类在自然界广泛分布的微生物，包括克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)，克雷伯氏产酸杆菌(Klebsi ella oxytoca)和克雷伯氏变栖杆菌(Klebsiella variicola)。这个菌属的细菌具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏属细菌用于生产1,3
‑
丙二醇、2,3
‑
丁二醇、2
‑
酮基葡萄糖酸、乙偶姻和异丁醇等化学产品。本专利技术以克雷伯氏菌属为起始菌株，通过基因工程方法改造菌株生产缬氨酸。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是，提供改造的克雷伯氏属细菌及其生产缬氨酸的方法。
[0006]本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术提供的改造的克雷伯氏属细菌，是指在克雷伯氏菌属细菌中失活α
‑
乙酰乳酸脱羧酶基因(budA)。
[0008]作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌在失活α
‑
乙酰乳酸脱羧酶基因的基础上，进一步失活乳酸脱氢酶基因(ldhA)、吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶基因(ipdC)、支链氨基酸转运体基因(brnQ)中一种或者多种。
[0009]作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌进一步高水平表达支链氨基酸转氨酶基因(ilvE)。
[0010]作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为α
‑
乙酰乳酸脱羧酶budA基因和
乳酸脱氢酶基因同时失活的克雷伯氏属细菌。
[0011]作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为α
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乙酰乳酸脱羧酶budA基因、乳酸脱氢酶ldhA基因和吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶ipdC基因同时失活的克雷伯氏属细菌。
[0012]作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为α
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乙酰乳酸脱羧酶budA基因、乳酸脱氢酶ldhA基因、吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶ipdC基因和支链氨基酸转运体brnQ基因同时失活的克雷伯氏属细菌。
[0013]作为优选实施方案，所述改造的克雷伯氏属细菌为α
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乙酰乳酸脱羧酶budA基因、乳酸脱氢酶ldhA基因、吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶ipdC基因和支链氨基酸转运体brnQ基因同时失活并过表达支链氨基酸转氨酶ilvE基因的克雷伯氏属细菌。
[0014]所述α
‑
乙酰乳酸脱羧酶是指能够催化α
‑
乙酰乳酸和乙偶姻之间转换的酶，其编码基因的名称为budA。其在克雷伯氏变栖杆菌342(基因组(GenBank：CP000964.1；NC_011283)中的基因阅读框如SEQIDNO.1所示。
[0015]所述乳酸脱氢酶是指能够催化丙酮酸形成乳酸的酶，其编码基因的名称为ldhA。其在克雷伯氏变栖杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQIDNO.2所示。
[0016]所述吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶是指催化吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧形成吲哚乙醛的酶，该酶也具有催化2
‑
酮异戊酸脱羧形成异丁醛的活性，其编码基因的名称为ipdC。其在克雷伯氏变栖杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQIDNO.3所示。
[0017]所述支链氨基酸转运体是指能够将胞外的缬氨酸转运到胞内的转运体，其编码基因的名称为brnQ。其在克雷伯氏变栖杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQIDNO.4所示。
[0018]所述支链氨基酸转氨酶是指催化2
‑
酮异戊酸通过转氨反应形成缬氨酸的酶，其编码基因的名称为ilvE。其在克雷伯氏变栖杆菌342基因组中的基因阅读框如SEQIDNO.5所示。
[0019]本专利技术还提供了所述改造的克雷伯氏属细菌在生产缬氨酸的应用。
[0020]本专利技术还提供了所述改造的克雷伯氏属细菌生产缬氨酸的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏属细菌接种到培养基中，进行发酵培养。
[0021]优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10
‑
50g/L，氮源1
‑
30g/L，无机盐0
‑
10g/L。
[0022]所述的碳源包括丙三醇(甘油)，以及葡萄糖、蔗糖、木糖等。
[0023]所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。
[0024]所述无机盐选择钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。
[0025]优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30
‑
40℃，发酵过程中充足供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5
‑
6.5之间。
[0026]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0027]1，本专利技术通过对α
‑
乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶、吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶和支链氨基酸转运体等酶蛋白的编码基因进行敲除，并在细胞中过表达支链氨基酸转氨酶。改造后的克雷伯氏属细菌利用甘油、葡萄糖等为碳源进行发酵培养时，碳源转化形成缬氨酸，并在发酵液中积累。
[0028]2，本专利技术通过研究发现：野生型克雷伯氏属细菌利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏属细菌是指在克雷伯氏菌属细菌中失活α
‑
乙酰乳酸脱羧酶基因。2.如权利要求1所述的改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏属细菌在失活α
‑
乙酰乳酸脱羧酶基因的基础上，进一步失活乳酸脱氢酶基因、吲哚
‑3‑
丙酮酸脱羧酶基因、支链氨基酸转运体基因中的一种或者多种。3.如权利要求1或2所述的改造的克雷伯氏属细菌，其特征在于：所述改造的克雷伯氏属细菌进一步高水平表达支链氨基酸转氨酶基因。4.权利要求1
‑
3任一项所述的改造的克雷伯氏属细菌生产缬氨酸的方法，该方法为：将改造的克雷伯氏属细菌接种到含碳源的培养基中进行发酵培养，菌体会利用碳源和氮源合成缬氨酸。5.如权利要求4所述的改造的克雷伯氏属细菌生产缬氨酸的方法，其特征在于：所述碳源选自葡萄糖、甘油、蔗糖、木糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝健，王卿惠，
申请(专利权)人：中国科学院上海高等研究院，
类型：发明
国别省市：