2,4-二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法技术

本发明专利技术公开了一种2,4

【技术实现步骤摘要】
2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法


[0001]本专利技术涉及一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法。

技术介绍

[0002]免疫学检测主要通过利用抗体
‑
抗原特异性，对体内需要检测的一些标志物进行免疫分析，但被检测物浓度低，需要偶联一些荧光基团进行级联放大。偶联物主要通过抗体上存在的一些高活性基团，如巯基、氨基、羟基、羧基以及其他可以偶联的基团，进行化学偶联。但存在一些问题。一是，大部分偶联物水溶性差，而抗体大部分都是在水溶液环境中，造成偶联物无法有效的溶于水溶液与抗体偶联；二是，偶联物上没有活化基团，需要进一步化学修饰，化学修饰本身可能会对偶联物产生一定影响；三是，偶联物与抗体之间存在偶联效率低的问题。因此，建立一种成熟的抗体偶联方法极其重要。理想的方法是通过简单的反应就能高效地将偶联物与抗体偶联。因此，点击反应，如比较经典的点击反应
‑
叠氮与炔基的1,3
‑
偶极环加成反应、D
‑
A反应、巯基与巯基反应以及巯基与烯烃的反应等等，成为抗体偶联的理想方法。该类反应具有生物相容性好的特性，不会产生生物毒性，且水溶性好，反应条件温和，几乎不用加热，因此不会影响抗体的活性，产物不用特殊纯化，可以直接用于免疫反应。同时在高分子偶联、生物传感分析、药物
‑
抗体偶联、纳米水凝胶的制备与应用方面也发挥着重要作用。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法。
[0004]本专利技术所提供的2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法，包括：
[0005]使巯基醇氧化，形成双(2
‑
羟乙基)二硫醚；
[0006]使双(2
‑
羟乙基)二硫醚氯甲酰化，获得氯甲酰化的双(2
‑
羟乙基)二硫醚，然后使氯甲酰化的双(2
‑
羟乙基)二硫醚与NHS反应，形成双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯；
[0007]使DNP前驱体与醇胺反应，形成含氨基的DNP，然后使所述含氨基的DNP与双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯反应，获得DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯，其中所述DNP前驱体为1
‑
氯
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
溴
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
碘
‑
2,4
‑
二硝基苯、或1
‑
氟
‑
2,4
‑
二硝基苯；以及
[0008]使DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯与抗体反应，获得DNP标记的抗体。
[0009]在某些实施方案中，所述巯基醇为巯基乙醇、巯基丙醇、巯基丁醇或巯基戊醇。
[0010]在某些实施方案中，在碱性条件下在所述相转移催化剂存在下使DNP前驱体与醇胺反应，形成含氨基的DNP。
[0011]在某些实施方案中，所述醇胺为甲醇胺、乙醇胺、3
‑
氨基
‑1‑
丙醇、4
‑
氨基
‑1‑
丁醇或5
‑
氨基
‑1‑
丁醇。
[0012]在某些实施方案中，所述相转移催化剂为四丁基溴化铵、四丁基氟化铵、三乙基己基溴化铵或三乙基辛基溴化铵。
[0013]在某些实施方案中，在缚酸剂存在下，使所述氯甲酰化的双(2
‑
羟乙基)二硫醚与
所述NHS反应，形成所述双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯。
[0014]在某些实施方案中，所述缚酸剂为吡啶、三乙胺或乙二胺。
[0015]在某些实施方案中，所述氯甲酰化采用氯甲酰化试剂进行，所述氯甲酰化试剂为光气、双光气或三光气。
[0016]在某些实施方案中，在还原剂的存在下，所述DNP从DNP标记的抗体上解离下来。
[0017]在某些实施方案中，所述还原剂为GSH、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐或β
‑
巯基乙醇。
[0018]本专利技术的2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法，能将DNP偶联至抗体，同时在特定条件，又能将DNP从抗体上解离下来。制备的DNP标记的抗体具有可控断裂性的化学键。DNP标记的抗体以生物相容性极高的二硫键作为可控断裂的偶联位点，在还原性环境，如GSH，就能实现二硫键与巯基之间的可逆交换。
附图说明
[0019]图1示出了双(2
‑
羟乙基)二硫醚的核磁共振氢谱图。
[0020]图2示出了双(2
‑
羟乙基)二硫醚氯甲酰化核磁共振氢谱图。
[0021]图3示出了双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯核磁共振氢谱图。
[0022]图4示出了2,4
‑
硝基苯氧基乙胺核磁共振氢谱图。
[0023]图5示出了DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯高效液相色谱图。
[0024]图6示出了DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯偶联至抗体上高效液相色谱图。
[0025]图7示出了DNP和Biotin标记的微珠荧光显色、荧光放大及还原剂处理后显微图。
具体实施方式
[0026]为实现上述目的，本专利技术提供了一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法，包括(1)还原性二硫化合物的构建；(2)含NHS酯的二硫化合物的构建；3)将DNP偶联至双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯的一端；和(4)将DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯标记至抗体。
[0027](1)还原性二硫化合物的构建
[0028]使巯基醇氧化，形成双(2
‑
羟乙基)二硫醚。
[0029]在反应溶剂1中，以巯基醇为前驱体，通过氧化剂的作用，将巯基乙醇的巯基氧化成二硫键，从而构建可还原性断裂的二硫化合物
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚。反应完后，通过硫代硫酸钠猝灭反应。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体可控断裂偶联的方法，包括：使巯基醇氧化，形成双(2
‑
羟乙基)二硫醚；使双(2
‑
羟乙基)二硫醚氯甲酰化，获得氯甲酰化的双(2
‑
羟乙基)二硫醚，然后使氯甲酰化的双(2
‑
羟乙基)二硫醚与NHS反应，形成双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯；使DNP前驱体与醇胺反应，形成含氨基的DNP，然后使所述含氨基的DNP与双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯反应，获得DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯，其中所述DNP前驱体为1
‑
氯
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
溴
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
碘
‑
2,4
‑
二硝基苯、或1
‑
氟
‑
2,4
‑
二硝基苯；以及使DNP
‑
双(2
‑
羟乙基)二硫醚
‑
NHS酯与抗体反应，获得DNP...

【专利技术属性】
技术研发人员：张迪鸣，张云山，
申请(专利权)人：之江实验室，
类型：发明
国别省市：