一种2,4-二硝基苯酚与抗体偶联的方法技术

本发明专利技术公开了一种2,4

【技术实现步骤摘要】
一种2,4
‑
二硝基苯酚与抗体偶联的方法


[0001]本专利技术涉及一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体偶联的方法。

技术介绍

[0002]DNP作为氧化磷酸化的解偶联剂，破坏氧化与磷酸化反应的偶联，从而消除线粒体内膜两侧的质子梯度，阻止了ATP的合成。DNP可以与其他生物活性分子偶联，如在酶联免疫吸附实验(ELISA)实验，需要大量DNP标记的二抗。DNP本身也是一种半抗原，通常用于免疫测定中标记一抗或二抗。单克隆抗DNP抗体对DNP具有特异性。然而，直接将DNP偶联至抗体上比较困难，且会影响抗体效价，因此采用温和条件，在水溶液中高效偶联，就需要对二硝基苯进行一定的化学修饰，一方面增加其水溶性，另外使其方便快捷的与抗体偶联，且不影响抗体本身的活性。这些偶联技术中的一些利用还原的半胱氨酸残基与抗体表面暴露的赖氨酸残基通过巯基与巯基在还原性环境中偶联。或者，利用马来酰亚胺介导的交联，将一个功能分子稳定地连接到半胱氨酸的硫醇基团上。目前许多努力都集中在抗体的位点特异性偶联策略上。

技术实现思路

[0003]针对上述问题，本专利技术提供了一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体偶联的方法。
[0004]本专利技术所提供的2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体偶联的方法，包括：
[0005]使乙二醇或其低聚物形成乙二醇或其低聚物的盐，然后再与DNP前驱体反应形成2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇；其中，所述DNP前驱体为1
‑
氯
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
溴
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
碘
‑
2,4
‑
二硝基苯、或1
‑
氟
‑
2,4
‑
二硝基苯；
[0006]使2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯化，获得2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯；
[0007]在碱性条件下，使所述2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯与NHS或N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺反应，获得DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯；以及
[0008]使DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯与抗体反应，获得偶联有DNP的抗体。
[0009]在一些实施方案中，所述乙二醇低聚物为二乙二醇、三乙二醇或三缩四乙二醇。
[0010]在一些实施方案中，在碱性试剂和相转移催化剂存在下，使所述乙二醇或其低聚物形成乙二醇或其低聚物的盐。
[0011]在一些实施方案中，所述碱性试剂为金属钾、金属钠、甲醇钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的任一种。
[0012]在一些实施方案中，所述相转移催化剂为苯甲基三乙基氯化铵、三辛基甲基氯化铵、四甲基溴化铵、四丙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基碘化铵、三乙基苄基溴化铵、三乙基己基溴化铵或三乙基辛基溴化铵。
[0013]在一些实施方案中，在反应溶剂中在缚酸剂存在下通过甲酰氯化试剂使2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯化。
[0014]在一些实施方案中，所述甲酰氯化试剂为光气、双光气或三光气。
[0015]在一些实施方案中，所述反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2二氯乙烷、四氢呋喃或乙醚。
[0016]在一些实施方案中，所述缚酸剂为碳酸钠、碳酸氢钠、乙二胺、吡啶或三乙胺。
[0017]在一些实施方案中，所述DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯与所述抗体在冰浴至室温的温度范围在反应溶剂中进行反应，所述反应溶剂为二甲亚砜、水、PBS缓冲溶液或四氢呋喃。
[0018]该方法采用DNP前驱体为起始原料，通过接枝乙二醇或其低聚物，增加其水溶性，然后通过碳酰氯作为与NHS连接的桥梁，最终接枝上NHS，以此构建DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯，DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯与抗体直接偶联，获得偶联有DNP的抗体。该方法可以使DNP方便地与抗体偶联，且不影响抗体自身活性。
附图说明
[0019]图1示出了2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇的核磁共振氢谱图。
[0020]图2示出了2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇的高效液相色谱图。
[0021]图3示出了DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯的核磁共振氢谱图。
[0022]图4示出了DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯的核磁共振碳谱图。
[0023]图5示出了DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯的高效液相色谱图。
[0024]图6示出了DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯与抗体偶联前的高效液相色谱图。
[0025]图7示出了DNP
‑
乙二醇
‑
NHS酯与抗体偶联后的高效液相色谱图。
[0026]图8示出了DNP和Biotin标记的聚苯乙烯微球荧光级联放大前后对比图。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种,2,4
‑
二硝基苯酚与抗体偶联合成的方法，该方法包括(a)DNP前驱体与乙二醇或低聚物偶联，(b)甲酰氯化，(c)接枝NHS，以及(d)DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯与抗体偶联。该方法的起始物为DNP前驱体，具体地以DNP前驱体为起始原料，以苯环1位上的氯作为连接位点，接枝乙二醇或其低聚物，增加原有DNP前驱体的水溶性，再以碳酰氯为连接桥梁，碳酰氯一端与DNP相连，另一端与NHS活性酯相连，获得DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯，DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯与抗体直接偶联，获得偶联有DNP的抗体。
[0028](a)DNP前驱体与乙二醇或其低聚物偶联
[0029]使乙二醇或其低聚物形成乙二醇或其低聚物的盐，然后与DNP前驱体反应形成2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇，其中所述DNP前驱体为1
‑
氯
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
溴
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
碘...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种2,4
‑
二硝基苯酚(DNP)与抗体偶联的方法，包括：使乙二醇或其低聚物形成乙二醇或其低聚物的盐，然后再与DNP前驱体反应形成2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇；其中，所述DNP前驱体为1
‑
氯
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
溴
‑
2,4
‑
二硝基苯、1
‑
碘
‑
2,4
‑
二硝基苯、或1
‑
氟
‑
2,4
‑
二硝基苯；使2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯化，获得2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯；在碱性条件下，使所述2
‑
(2,4
‑
二硝基苯氧基)醇甲酰氯与NHS或N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺反应，获得DNP
‑
(乙二醇)n
‑
NHS酯；以及使DNP
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(乙二醇)n
‑
NHS酯与抗体反应，获得偶联有...

【专利技术属性】
技术研发人员：张迪鸣，张云山，
申请(专利权)人：之江实验室，
类型：发明
国别省市：