仿骨dECM材料的制备、复合支架体系及其在肿瘤早期转移评估中的应用制造技术

本发明专利技术公开的仿骨dECM材料的制备、复合支架体系及其在肿瘤早期转移评估中的应用。仿骨dECM材料包括仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料，仿骨基质材料为MC3T3

【技术实现步骤摘要】
仿骨dECM材料的制备、复合支架体系及其在肿瘤早期转移评估中的应用


[0001]本专利技术涉及生物医学工程中生物材料和组织工程
，具体涉及一种仿骨dECM材料的制备、复合支架体系及其在肿瘤早期转移评估中的应用。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，而其后期转移是造成高死亡率的主要原因。骨作为多种肿瘤最常见的转移部位，会引起严重的骨相关事件，导致患者死亡。目前，临床上主要通过影像学诊断肿瘤的骨转移。然而，传统的骨扫描CT主要依据溶骨性骨皮质病变损害情况加以诊断，当影像学上呈骨皮质典型的病理影像特征时，患者往往已经存在肿瘤的骨转移定植，为临床肿瘤骨转移的治疗带来极大的困难。因此，利用影像学诊断肿瘤早期骨转移存在灵敏度不足的缺陷。
[0003]近年来，循环肿瘤细胞在肿瘤的早期诊断应用得到了广泛的关注。循环肿瘤细胞的诊断技术有助于肿瘤细胞在转移部位定植之前识别癌细胞的转移，并为临床早期防治提供重要的理论依据，为肿瘤的诊断及其预后预测起到了至关重要的作用。与影像学相比，循环肿瘤细胞的诊断方法具有更为优异的灵敏性。尽管如此，循环肿瘤细胞检测对于细胞的分离捕获技术要求极高，这限制了其临床的应用。此外，有大量的研究表明肿瘤患者的体液样本中长期存在肿瘤细胞，但并未发生靶器官的肿瘤转移。据此，循环肿瘤细胞检测方法诊断乳腺癌骨转移的发生依旧缺乏一定的特异性。
[0004]因此，急需开发高敏感性、高特异性，并能有效模拟癌细胞骨组织定植的新方法，用于肿瘤骨转移的早期筛查与诊断。早在1889年，Stephen Paget就针对肿瘤转移的器官特异性提出了经典的“种子
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土壤”学说，此后越来越多的证据证实肿瘤转移需要肿瘤细胞与组织微环境的相互协调，一方面靶向的组织器官提供适合肿瘤细胞生长的微环境，另一方面肿瘤细胞通过分泌细胞因子等方式影响靶向组织的细胞活动，改变组织微环境，进一步促进肿瘤细胞募集、生长。大量临床数据表明，乳腺癌远端转移与肿瘤大小无显著相关性，主要取决于肿瘤细胞本身。部分恶性高的肿瘤细胞在原位肿瘤很小时已具备浸润能力和远端转移风险。因此，如果能利用靶器官骨组织微环境来评估癌细胞的潜在骨转移能力，将大大提高诊断的敏感性和特异性，促进癌骨转移的早期诊断和干预，提高肿瘤患者术后生存率。这里，我们分别利用正常成骨细胞和骨肉瘤细胞来源的脱细胞基质(dECM)，模拟不同状态下的骨基质微环境，提出一种仿骨dECM材料的制备、复合支架体系及其在肿瘤早期转移评估中的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是，针对现有技术的不足，提供一种仿骨dECM材料的制备、复合支架体系及其在肿瘤早期转移评估中的应用。
[0006]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种仿骨dECM材料的制备方法，
所述的仿骨dECM材料包括仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料，所述的仿骨基质材料为MC3T3
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E1细胞来源的dECM基质，所述的仿骨肿瘤基质材料为MG63细胞来源的dECM基质，所述的仿骨dECM材料的制备方法包括以下步骤：
[0007](1)、成骨细胞与骨肉瘤细胞的体外培养
[0008]配制含10％胎牛血清的α
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MEM培养基作为细胞培养液，在条件为37℃、含5％CO2的细胞培养箱内，分别对成骨细胞MC3T3
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E1和骨肉瘤细胞MG63进行培养，培养过程分别为：当细胞汇合度达到70～80％时，弃去原有的培养液，加入200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，清洗3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25wt％的胰酶，并置于37℃的细胞培养箱内温育2分钟；通过显微镜观察到细胞基本呈漂浮状态时，证明胰酶消化成功，随即加入与胰酶等体积的新鲜细胞培养液，并收集细胞悬液置于15mL的无菌离心管内；再次用200μL/cm2的无菌PBS缓冲液冲洗培养皿，收集剩余的细胞悬液并加入到上述15mL的无菌离心管内；经速度为1500rpm的离心2min处理后，弃去管内上清液，加入1mL新鲜的细胞培养液并使用无菌1mL枪头吹打混匀获得细胞悬液，用细胞计数板对该细胞悬液进行计数，通过计算得到1mL细胞悬液内的细胞个数，按细胞密度为1
×
105个细胞/孔接种于12孔细胞培养板内，充分摇晃使细胞悬液内的细胞分布均匀，将细胞培养板置于细胞培养箱内，用细胞培养液培养5天，隔天换液处理；随后，用含50μg/mL抗坏血酸的细胞培养液继续培养7天，即分别完成成骨细胞与骨肉瘤细胞的体外培养；
[0009](2)、成骨细胞与骨肉瘤细胞的脱细胞处理
[0010]成骨细胞与骨肉瘤细胞的脱细胞处理过程分别为：弃去细胞培养板内的细胞培养液，加入200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，清洗3次；加入37℃预热的含0.5％TritonX
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100的无菌PBS溶液，并放入37℃的细胞培养箱内温浴8min，观察处理后细胞培养板内的细胞形态，当细胞呈皱缩样变化后，弃去TritonX
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100溶液，加入37℃预热的200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，清洗3次；将细胞培养板周围缠绕3圈封口膜并用无菌袋密封，置于
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80℃冰箱内冷冻处理4小时后，在超净台内加入37℃预热的200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，置于37℃的细胞培养箱内处理40分钟后，弃去PBS溶液，即完成1次冻融处理过程，再重复上述冻融处理过程2次；将37℃预热的含DNase 50U/mL、RNase 50μg/mL的无菌PBS溶液加入到细胞培养板内，置于37℃的细胞培养箱内处理2小时，弃去处理液，完成脱细胞过程，即获得MC3T3
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E1细胞来源的dECM基质作为仿骨基质材料，并获得MG63细胞来源的dECM基质作为仿骨肿瘤基质材料；
[0011](3)仿骨dECM材料的保存
[0012]将培养有仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料的两块细胞培养板的周围分别缠绕3圈封口膜并用无菌袋密封，置于
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80℃冰箱内存储备用。
[0013]基于仿骨dECM材料构建的复合支架体系，包括固相材料，该固相材料由上述方法制备的仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料修饰。
[0014]作为优选，所述的固相材料为小肠粘膜下层SIS。
[0015]作为优选，该复合支架体系包括含仿骨基质的SIS支架与含仿骨肿瘤基质的SIS支架，其制备方法包括以下步骤：
[0016]S1、SIS片层的处理
[0017]取一张干的SIS片层，即小肠粘膜下层片层，用5mm打孔器将SIS片层切割为多片5mm直径的SIS圆片；将多片SIS圆片分别放到96孔的细胞培养板中，加入培养液浸泡24h，备
用；
[0018]S2、含仿骨基质的SIS支架与含仿骨肿瘤基质的SIS支架的初步制备
[0019]配制含10％胎牛血清的α
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MEM培养基作为细胞培养液，在条件为37℃、含5％本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种仿骨dECM材料的制备方法，其特征在于，所述的仿骨dECM材料包括仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料，所述的仿骨基质材料为MC3T3
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E1细胞来源的dECM基质，所述的仿骨肿瘤基质材料为MG63细胞来源的dECM基质，所述的仿骨dECM材料的制备方法包括以下步骤：(1)、成骨细胞与骨肉瘤细胞的体外培养配制含10％胎牛血清的α
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MEM培养基作为细胞培养液，在条件为37℃、含5％CO2的细胞培养箱内，分别对成骨细胞MC3T3
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E1和骨肉瘤细胞MG63进行培养，培养过程分别为：当细胞汇合度达到70～80％时，弃去原有的培养液，加入200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，清洗3次；再加入用量为40～50μL/cm2的0.25wt％的胰酶，并置于37℃的细胞培养箱内温育2分钟；通过显微镜观察到细胞基本呈漂浮状态时，证明胰酶消化成功，随即加入与胰酶等体积的新鲜细胞培养液，并收集细胞悬液置于15mL的无菌离心管内；再次用200μL/cm2的无菌PBS缓冲液冲洗培养皿，收集剩余的细胞悬液并加入到上述15mL的无菌离心管内；经速度为1500rpm的离心2min处理后，弃去管内上清液，加入1mL新鲜的细胞培养液并使用无菌1mL枪头吹打混匀获得细胞悬液，用细胞计数板对该细胞悬液进行计数，通过计算得到1mL细胞悬液内的细胞个数，按细胞密度为1
×
105个细胞/孔接种于12孔细胞培养板内，充分摇晃使细胞悬液内的细胞分布均匀，将细胞培养板置于细胞培养箱内，用细胞培养液培养5天，隔天换液处理；随后，用含50μg/mL抗坏血酸的细胞培养液继续培养7天，即分别完成成骨细胞与骨肉瘤细胞的体外培养；(2)、成骨细胞与骨肉瘤细胞的脱细胞处理成骨细胞与骨肉瘤细胞的脱细胞处理过程分别为：弃去细胞培养板内的细胞培养液，加入200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，清洗3次；加入37℃预热的含0.5％TritonX
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100的无菌PBS溶液，并放入37℃的细胞培养箱内温浴8min，观察处理后细胞培养板内的细胞形态，当细胞呈皱缩样变化后，弃去TritonX
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100溶液，加入37℃预热的200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，清洗3次；将细胞培养板周围缠绕3圈封口膜并用无菌袋密封，置于
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80℃冰箱内冷冻处理4小时后，在超净台内加入37℃预热的200μL/cm2的无菌PBS缓冲液，置于37℃的细胞培养箱内处理40分钟后，弃去PBS溶液，即完成1次冻融处理过程，再重复上述冻融处理过程2次；将37℃预热的含DNase 50U/mL、RNase 50μg/mL的无菌PBS溶液加入到细胞培养板内，置于37℃的细胞培养箱内处理2小时，弃去处理液，完成脱细胞过程，即获得MC3T3
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E1细胞来源的dECM基质作为仿骨基质材料，并获得MG63细胞来源的dECM基质作为仿骨肿瘤基质材料；(3)仿骨dECM材料的保存将培养有仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料的两块细胞培养板的周围分别缠绕3圈封口膜并用无菌袋密封，置于
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80℃冰箱内存储备用。2.基于仿骨dECM材料构建的复合支架体系，其特征在于，包括固相材料，该固相材料由权利要求1制备的仿骨基质材料和仿骨肿瘤基质材料修饰。3.根据权利要求2所述的基于仿骨dECM...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵基源，李梅，翁博文，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：