一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒，属于动物病毒抗体检测领域。所述包括犬埃里希体MAP2

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒
[0001]相关专利
[0002]本申请是申请号为2020114758176，申请日为2020年12月14日，专利技术名称为“一种犬埃里希体MAP2
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gp19重组蛋白及其制备方法和应用”的中国专利技术专利申请的分案申请。


[0003]本专利技术属于动物病毒抗体检测领域，具体地，涉及一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒。

技术介绍

[0004]犬埃里希体病(Canine Ehrlichiosis)是由牛蜱传染犬埃里希体(Ehrlichiosis canis)引起的一种犬败血性传染病。家犬、野犬和啮齿类动物是本病的宿主。多种不同性别、年龄和品种的犬均可感染本病。此种疾病潜伏期8～12天。病犬周期性发热，食欲不振，流黏液脓液性鼻液和眼眵，贫血，体重减轻。
[0005]目前临床中较为直接的诊断方法为血涂片染色法，间接荧光抗体试验(Indirect fluorescence antibody，IFA)和酶联免疫吸附试验(Enzyme
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Linked immunosorbent assay，ELISA)等免疫学方法，此外PCR(聚合酶链式反应)法也是一种常用于埃里希的诊断，是用于诊断埃里希病最为敏感和特异性较高的检测方法。但是上述的免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)技术等方法需要使用指定的仪器设备、具备相应的试验条件和技能，难以在基层推广。
[0006]埃里希体抗体检测方面，目前国内外研究的主要方向均是使用一种或几种部分序列进行检测抗体，这种情况势必有漏检的风险。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
[0008]本专利技术第一方面提供一种犬埃里希体MAP2
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gp19重组蛋白，包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
[0009]在本专利技术中，重组蛋白也叫融合蛋白或重组融合蛋白，是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
[0010]MAP2(Major Antigenic Protein 2)、外膜蛋白(Major Outer Membrane Protein)如P30、P30a、P30
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1和糖蛋白(Glycoprotein)如gp19等蛋白是犬埃里希主要的免疫原蛋白，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答。本专利技术将MAP2、P30和gp19蛋白的全长序列融合在一起表达，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应。
[0011]在本专利技术的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。
[0012]本专利技术的第二方面提供一种编码本专利技术第一方面所述重组蛋白的基因，其包括
Imidazole，pH8.0。
[0034]本专利技术的第六方面提供本专利技术第一方面所述的重组蛋白在制备用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒中的应用。
[0035]本专利技术的第七方面提供一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒，包括本专利技术第一方面所述的重组蛋白。
[0036]进一步地，所述试剂盒还包括鼠IgG和羊抗鼠IgG。
[0037]在本专利技术的一些实施方案中，利用双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体。
[0038]在本专利技术的一些具体实施方案中，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的试剂方法如下：
[0039]S1，分别制备重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；
[0040]S2，将所述重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；
[0041]S3，利用重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；
[0042]S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线(T线)，质控区有质控线(C线)，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。
[0043]在使用时，滴加犬生物样本至样本垫处，室温放置10min后判定检测结果，判定标准如下：
[0044]①
两条带出现，其中一条位于质控区，另一条位于测试区，为阳性；
[0045]②
仅质控线出现一条带，在测试区内无条带出现，为阴性；
[0046]③
质控线未出现条带，表明此测试条已损坏，无论检测线是否出现条带，均应当更换新试纸条重新测试。
[0047]在本专利技术的一些实施方案中，犬埃里希体抗体检测结果呈阳性，代表犬生物样本中含有犬埃里希体抗体，意味着犬具有犬埃里希体感染或曾被犬埃里希体感染。
[0048]在本专利技术的一些实施方案中，所述生物样本为血清或血浆，或任何其他可能包含抗体的体液。
[0049]本专利技术的有益效果
[0050]相对于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：
[0051]MAP2、P30和gp19蛋白是犬埃里希体主要的免疫原性抗原且高度保守，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答，诱导宿主细胞产生中和抗体，因此将MAP2、P30和gp19蛋白全长序列融合在一起表达，不仅能够提高诊断的灵敏度，还能减少与其他病原体的交叉反应，特异性强，具有巨大的临床意义和和广泛的应用前景。
[0052]本专利技术采用的胶体金标记免疫分析法是一种新型分析技术，具有快捷简便、成本低、无污染且无需培训的特点，与传统方法相比更为适合现场检测,具有显色时间短、无需昂贵仪器等优点，有广阔的市场前景和应用价值。
附图说明
[0053]图1示出了犬埃里希体MAP2
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gp19融合蛋白纯化的凝胶电泳结果。1：细胞破碎后上样；2：流穿；3：50mM Imidazole洗脱；4：0.5M Imidazole洗脱。
[0054]图2示出了本专利技术一个实施例的检测试纸条的试剂图。1：样本垫；2：金标垫；3：NC膜；31：检测线(T线)；32：质控线(C线)；4：滤纸；5：底板。
[0055]图3示出了本专利技术的一个实施例利用试纸条进行检测的结果示意图。T：检测线，C：质控线。
[0056]图4示出了利用本专利技术的试纸条对临床犬血清样本进行检测的总体结果。
具体实施方式
[0057]为了使本专利技术所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。
[0058]实施例
[0059]以下例子在此用于示范本专利技术的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表专利技术人发现的可以用于实施本专利技术的技术，因此可以视为实施本专利技术的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬埃里希体抗体的试剂盒，其特征在于，包括犬埃里希体MAP2
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gp19重组蛋白、鼠IgG和羊抗鼠IgG，所述MAP2
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gp19重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用双抗原夹心金标法检测犬埃里希体抗体。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括双抗原夹心金标法检测条，所述检测条的制备方法如下：S1，分别制备MAP2
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gp19重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物；S2，将所述MAP2
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gp19重组蛋白胶体金复合物和鼠IgG胶体金复合物混合，制备金标垫；S3，利用MAP2
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gp19重组蛋白作为检测线，利用羊抗鼠IgG作为质控线，划在硝酸纤维素膜上；S4，将滤纸、含有硝酸纤维素膜的聚酯板、金标垫和样本垫安装在底板上，其中滤纸叠加一部分压在聚酯板上，聚酯板叠加一部分压在金标垫上，金标垫叠加一部分压在样本垫上，在聚酯板上分别有测试区和质控区，测试区有检测线，质控区有质控线，检测线靠近金标垫，质控线靠近滤纸，即制备得到检测条。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述MAP2
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gp19重组蛋白胶体金复合物的制备方法如下：取胶体金溶液100mL放入烧杯中，搅拌加入0.2M K2CO3调节金水pH至6.5，搅拌后加入1.2mg纯化后的MAP2
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gp19重组蛋白，室温搅拌15min，加入1mL10％BSA溶液，室温搅拌15min后12000rpm离心10min，将上清小心吸出弃去，沉淀用金标稀释液定容至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓光，何坚锋，王哲侃，
申请(专利权)人：杭州亿米诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：