偶联物在制备检测试剂中的用途制造技术

本申请涉及偶联物在制备检测试剂中的用途。具体而言，本申请的6

【技术实现步骤摘要】
偶联物在制备检测试剂中的用途
[0001]本申请是2019年12月27日提交的专利申请201911372535.0《6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备洋地黄毒苷检测试剂中的用途》的分案申请。


[0002]本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种突变的酶6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在洋地黄毒苷检测试剂盒中的应用。

技术介绍

[0003]半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。
[0004]半抗原能与对应抗体结合出现抗原
‑
抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。半抗原一旦与蛋白结合，就构成该蛋白质的一个抗原簇。一些比一般半抗原分子量小，但有特异结构的化学活性基团物质(如青霉素、磺胺剂等)，称为简单半抗原。
[0005]小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
[0006]洋地黄毒苷(Digitoxin，DG)结构式如下所示：
[0007][0008]洋地黄毒苷属于天然存在的一类强心苷(CG)，由紫花洋地黄、毛花洋地黄或其他适合洋地黄中获得的强心苷。
[0009]洋地黄毒苷大量在胃肠道吸收快速且完全，体内代谢缓慢，在肝代谢，大部分代谢产物无活性。地高辛常用于心力衰竭，适应症为充血性心力衰竭和心率失常，由于其作用慢
而持久，尤其适用于慢性心功能不全患者长期服用。洋地黄毒苷与Na
+
/K
+
‑
ATP酶在细胞膜上可逆性结合，阻止了酶与ATP的结合，抑制了Na
+
与K
+
的主动转运，使细胞内的Na
+
增加，K
+
减少，这是洋地黄苷类的直接电生理作用及毒性是由此而来。
[0010]洋地黄毒苷用药量应根据患者个体需要仔细调整。洋地黄毒苷治疗性稳态血浆浓度为10至25ng/mL，更高的浓度(30ng/mL)可能伴有毒性。因此，临床上需要有效监控患者体内的洋地黄毒苷浓度。
[0011]目前已知的洋地黄毒苷检测方法主要有：化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。
[0012]均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原(如G6PDH
‑
洋地黄毒苷)与非标记抗原(洋地黄毒苷)，竞争与定量的抗体(洋地黄毒苷抗体)进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中洋地黄毒苷的含量。
[0013]现有的均相酶免疫测定法、胶乳凝集比浊法常常因制备工艺复杂、批间差大，应用受到一定限制。CN102768284A中描述了一种小分子药物
‑
G6PDH酶偶联物的制备方法。然而，现有技术的方法依赖于对小分子药物自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的策略难以保证小分子药物和酶之间的定向反应，而导致批间差异大。

技术实现思路

[0014]鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备洋地黄毒苷检测试剂盒中的用途。
[0015]根据一些实施方案，提供了一种6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。区别于已有发表的专利US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose
‑6‑
phosphate dehydrogenases)的6磷酸葡萄糖脱氢酶的突变体，本申请的6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变：D306C、G426C、D375C。
[0016]根据一些实施方案，提供了一种6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是选自以下的序列所示：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
[0017]根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。
[0018]根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。
[0019]根据一些实施方案，提供了一种宿主细胞，其包含本申请的表达载体。宿主细胞可以是原核(如细菌)或真核(如酵母)。
[0020]根据一些实施方案，提供了一种偶联物，其是本申请的6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩尔比1：n偶联而成。
[0021]在一些实施方案中，n是1至50，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50。
[0022]在一些具体的实施方案中，本申请的6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与半抗原按照摩
尔比优选为1：1。
[0023]在一些具体的实施方案中，半抗原的分子量为100Da至4000Da，例如：100、150、200、250、300、350、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、520、550、570、600、620、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000。
[0024]根据本申请，技术人员将理解，“半本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.偶联物在制备检测试剂中的用途：所述检测试剂是洋地黄毒苷的均相酶免疫法检测试剂；所述偶联物是6
‑
磷酸葡萄糖脱氢酶突变体与洋地黄毒苷衍生物偶联而成；所述洋地黄毒苷衍生物是式I所示：其中，m为1至10的整数，优选m为1至6的整数；X选自：马来酰亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：封建新，张启飞，龚俊，刘希，
申请(专利权)人：北京九强生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：