一种胶原蛋白三螺旋比例的检测方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种胶原蛋白三螺旋比例的检测方法。本发明专利技术的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法包括：将三螺旋胶原蛋白标准品与胶原蛋白单体标准品按照不同比例混合得到不同三螺旋比例的胶原蛋白标准品，采用天狼星红染色法对所述不同三螺旋比例的胶原蛋白标准品进行吸光值检测，根据三螺旋比例与吸光值制作标准曲线。该方法能够实现胶原蛋白三螺旋比例的快速、低成本定量，具有较高的特异性和准确度以及较好的重复性，可广泛应用于胶原蛋白产业。应用于胶原蛋白产业。

【技术实现步骤摘要】
一种胶原蛋白三螺旋比例的检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，尤其涉及一种胶原蛋白三螺旋比例的检测方法。

技术介绍

[0002]胶原蛋白是一种生物高分子蛋白，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白，占蛋白质总量的25％～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。胶原蛋白作为天然的生物高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性和吸收性以及促上皮细胞等细胞形成等功能，广泛应用于医学、美容、化妆品、保健品等领域。
[0003]胶原蛋白种类较多，常见类型为I型、Ⅱ型、Ⅲ型、V型和
Ⅺ
型。所有胶原家族成员都有一个特征：由三条α链组成的右手三螺旋结构。其中三条链可以相同(同源三聚体)，也可以不同(异源三聚体)。分子内的三条α链中，每一条都形成一个延伸的左旋螺旋，这三条链再以右手螺旋的方式绕着中心轴超螺旋盘绕形成了三螺旋结构。蛋白质的功能决定于它的结构，只有具有完整三螺旋稳定结构的胶原蛋白才能发挥它所有的功效。
[0004]胶原蛋白在医美、护肤品行业有着广泛的应用。目前市面上的胶原蛋白来源有两种，一种是天然提取，主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，由于来源受限，供应量远低于需求量；另一种来源是通过酵母或其他表达体系发酵生产的重组人源胶原蛋白，然而目前重组胶原蛋白的结构特征和生物活性，尤其在羟基化程度以及三螺旋胶原结构方面，较天然胶原蛋白仍然有巨大差距。而且，胶原蛋白的三螺旋结构极易受到加工环境与其他外界条件的影响，如外界的温度、压力和加工生产时引入的化学试剂等因素，这些因素都会导致胶原蛋白三螺旋结构的破坏，影响其生物活性。因此，如何使重组胶原蛋白形成三螺旋，以及如何提高三螺旋比例，已成为科研机构及生物企业的研发重点。在重组胶原蛋白的生产菌株构建、发酵和纯化过程中，均需要以三螺旋比例这一指标为指导。因此建立一种简单、快速、低成本的检测胶原产物中三螺旋比例的方法至关重要。
[0005]目前已有的胶原蛋白检测方法主要包括：
[0006]1、圆二色谱法：为胶原蛋白三螺旋结构的定性检测方法，其特征为：在约198nm处有一个强的负吸收，在约220nm处有一个较弱的正吸收，吸收的强度能反应胶原蛋白三螺旋结构的保留程度。
[0007]2、红外光谱法：为胶原蛋白三螺旋结构的定性检测方法，其通过观测特定键能的吸收反应蛋白质的二级结构变化。
[0008]上述两种方法虽然可以对胶原蛋白的三螺旋结构进行检测，但不能确定具体的含量，仅为一种定性方法，无法实现三螺旋结构比例的定量检测，且两种方法对于设备的要求较高，检测成本较高。两种分析方法都有一定局限性，圆二色谱只能用来分析很窄范围内的澄清溶液，因此单一的表征往往不能全面系统地解析温度对胶原蛋白结构的影响；红外光谱检测分子振动时产生的偶极矩变化，对极性基团敏感。因此目前这两种方法均无法实现
快速、准确定量胶原蛋白中三螺旋结构成分。
[0009]3、检测酶解液中羟脯氨酸含量：为胶原蛋白三螺旋结构的定量检测方法，利用具有完整三股螺旋结构的胶原蛋白不能被胰蛋白酶酶解，而三股螺旋结构完全破坏或部分破坏的胶原蛋白能被胰蛋白酶酶解的原理，通过检测胰蛋白酶酶解前后胶原蛋白溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量变化，计算得到胶原蛋白中具有完整三股螺旋结构的含量。
[0010]上述利用胰蛋白酶或胃蛋白酶酶切的方法来破坏胶原蛋白的三螺旋结构的检测方法与无需破坏三螺旋结构的胶原蛋白检测方法相比也存在缺点。首先，蛋白酶的酶切条件对于不同的蛋白存在差异，例如pH、时间、蛋白酶比例等条件都需要进行特定的实验来确定，条件不合适可能会造成酶切不完全从而产生定量误差。而且，溶液体系中胶原蛋白的特征氨基酸—羟脯氨酸的含量检测前需要利用三氯乙酸沉淀法，三氯乙酸浓度、温度和离子强度等因素对胶原蛋白沉淀均有影响，即因三氯乙酸浓度、温度和离子强度不同，可能会导致沉淀物质及沉淀效果不同，同时沉淀中是否保留不完整的胶原蛋白三螺旋结构和上清液中是否存在完整的胶原蛋白三螺旋结构尚未确定。
[0011]4、通过凝胶电泳成像系统或薄层扫描系统检测酶解液中二聚体蛋白含量：为胶原蛋白的定量检测方法，可计算胶原蛋白样品的三螺旋结构的保留率。其基本原理为具有完整三螺旋结构的胶原蛋白对蛋白酶的酶解具有抗性，而三螺旋结构丧失或者部分丧失的胶原蛋白易于被蛋白酶分解成小分子量的肽段，通过SDS
‑
PAGE可以对被分解的肽段进行可视化分析，被分解的肽段越多，则表明胶原蛋白样品三螺旋结构的完整性越差；反之，如果SDS
‑
PAGE没有被分解的小分子肽段的出现，则表明胶原蛋白样品三螺旋结构的完整性较好。该方法在操作过程中存在较大的主观性，与SDS
‑
PAGE的凝胶性质、染色及脱色时间存在较大关系，且在使用凝胶电泳成像系统或薄层扫描系统检测过程中结果重复效果差，无法确保每次定量的准确性。
[0012]5、二硫化物纳米材料检测胶原蛋白三螺旋结构：该方法是通过二硫化物纳米材料能够准确的检测胶原蛋白的三螺旋结构的原理实现的，步骤如下：将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液中，形成第一体系；将二硫化物纳米材料溶液加入到探针多肽溶液和待测多肽溶液的混合溶液，形成第二体系；检测并判断第一体系和第二体系的荧光强度大小，以确定第二体系中探针多肽与待测多肽是否生成了胶原蛋白三螺旋结构；其中，所述第一体系中的探针多肽的浓度与所述第二体系中探针多肽的浓度相等，探针多肽为用荧光分子进行修饰过的具有特定序列的胶原多肽。该方法存在以下缺陷：首先制备荧光探针时操作复杂；其次，该方法通过探针多肽与待测多肽形成胶原蛋白三螺旋结构，进而检测该三螺旋结构，并非检测体系中原本存在的胶原蛋白三股螺旋结构，其准确性存在差异；最后，胶原溶液具有高粘度的特性，但该方法较难测定高粘度的胶原体系中三股螺旋结构的含量。
[0013]6、天狼星红染色法：天狼星红是一种强酸性阴离子染料，每个分子含有6个磺酸基，易与胶原蛋白的碱性氨基酸基团紧密结合，染色后不褪色且具有特异性。利用天狼星红与胶原蛋白特异性结合的原理，经NaOH洗脱离心后获得红色复合物，在特定波长540
‑
560nm条件下通过测定吸光度确定胶原含量。专利申请CN103776778A利用乙酸溶液配制胶原蛋白溶液，用天狼猩红染色后，离心并测定上清液的吸光度，绘制标准曲线，定量胶原蛋白含量。
然而，该方法仅能够对动物组织中的100％三螺旋胶原蛋白进行含量测定，而无法对混合有三螺旋结构和单体结构的胶原蛋白(如重组胶原蛋白)中的三螺旋结构的占比进行准确测定。
[0014]综上所述，亟需建立一种简单、快速、低成本的检测胶原产物中三螺旋比例的方法。

技术实现思路

[0015]本专利技术提供一种胶原蛋白三螺旋比例的检测方法。
[0016]具体地，本专利技术提供以下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述方法包括：将三螺旋胶原蛋白标准品与胶原蛋白单体标准品按照不同比例混合得到不同三螺旋比例的胶原蛋白标准品，采用天狼星红染色法对所述不同三螺旋比例的胶原蛋白标准品进行吸光值检测，根据三螺旋比例与吸光值制作标准曲线。2.根据权利要求1所述的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述胶原蛋白单体标准品的制备方法包括：将所述三螺旋胶原蛋白标准品于pH 6
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8、65
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100℃条件下处理。3.根据权利要求2所述的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述处理的时间为10
‑
30min。4.根据权利要求1～3任一项所述的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述不同三螺旋比例的胶原蛋白标准品的浓度相同。5.根据权利要求1～4任一项所述的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述三螺旋胶原蛋白标准品为100％三螺旋胶原蛋白标准品；和/或，所述不同三螺旋比例的胶原蛋白标准品中，三螺旋比例为0
‑
100％。6.根据权利要求1～5任一项所述的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：采用天狼星红染色法对待测样品的吸光值进行检测，根据所述标准曲线，计算所述待测样品的三螺旋比例。7.根据权利要求1～6任一项所述的胶原蛋白三螺旋比例的检测方法，其特征在于，所述天狼星红染色法使用的染色液和洗涤液中含有表面活性剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘学莉，张一博，王波，蒋天宇，李欣茹，谈畅，
申请(专利权)人：上海蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：