L-生物素、基于其的标记及它们的用途制造技术

本发明专利技术旨在提供使试样中的L

【技术实现步骤摘要】
L
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生物素、基于其的标记及它们的用途


[0001]本专利技术涉及L
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生物素测定用试剂。本专利技术涉及含L
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生物素的试样的测定方法。本专利技术涉及被L
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生物素标记的物质的标记数的确定方法。本专利技术涉及固定化旋光异构性亲和素类的固相的制造方法。

技术介绍

[0002]由于亲和素及链霉亲和素与D
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生物素具有非常高的亲和性，以往常利用于免疫学测定。例如，在使用被D
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生物素标记的抗体和固定化亲和素的固相对生物体试样中的目标物质进行测定时，由所述抗体捕获的目标物质经D
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生物素和亲和素的结合而固定于固相上。通过利用例如化学发光法检测此固相上的目标物质，可对目标物质进行高灵敏度测定。
[0003]在使用被D
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生物素标记的抗体的免疫学测定中，与1分子的抗体结合的D
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生物素的数影响测定结果。因此，对与抗体结合的D
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生物素进行定量变得必要。例如，在非专利文献1中记载了能测定与抗体等蛋白质结合的D
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生物素或游离的D
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生物素的生物素定量试剂盒。此试剂盒具备含4'
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羟基偶氮苯
‑2‑
羧酸(以下，也称为“HABA”)和亲和素的混合物的试剂。此试剂盒利用HABA和亲和素结合而形成具有中心波长500nm的光吸收的复合体，及所述复合体中的HABA容易被取代为D<br/>‑
生物素而在500nm的吸收降低。由于吸收的降低的程度依赖于试样中的生物素浓度，在使用所述试剂盒的生物素的测定方法中，基于在500nm的吸光度而测定生物素浓度。这样的生物素的测定方法也称为HABA法。
[0004]【现有技术文献】
[0005]【非专利文献】
[0006]【非专利文献1】Pierce(商标)Biotin Quantitation Kit(制品编号：28005)的操作说明书,Thermo Fisher Scientific公司
[0007]【专利技术的概要】
[0008]【专利技术要解决的课题】
[0009]在血液等的生物体试样中，有由含有生物素的辅助物的摄取等，游离的D
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生物素以高浓度含在生物体试样中的情况。生物体试样中的游离的D
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生物素有与被D
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生物素标记的抗体竞争结合而影响测定结果的情况。为了解决这样的问题，本专利技术人开发被作为D
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生物素的光学异构体的L
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生物素标记的捕获体和固定化基本上不与D
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生物素结合、使用与L
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生物素结合的旋光异构性亲和素类的固相的免疫学测定法。一方面，在所述测定法中，也有管理与1分子的捕获体结合的L
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生物素的数的必要。但是，不知晓能测定与蛋白质等结合的L
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生物素或游离的L
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生物素的方法或试剂。非专利文献1中记载的试剂盒也能测定D
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生物素，但不能测定L
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生物素。从而，本专利技术旨在提供使L
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生物素的测定变得可能的手段。
[0010]【用于解决课题的手段】
[0011]本专利技术人发现可由含旋光异构性亲和素类和HABA的试剂与HABA法同样测定试样中的L
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生物素，从而完成本专利技术。从而，本专利技术提供L
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生物素测定用试剂，其含旋光异构性亲和素类和下述的式(I)所表示的偶氮苯衍生物。
[0012]【化1】
[0013][0014](式中，R1～R
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各自独立地是选自下列的基团：氢原子、羟基、羧基、非取代或具有取代基的C1～C6二烷基氨基、非取代或具有取代基的C1～C6烷基及非取代或具有取代基的C1～C6烷氧基，但是，R1～R5的至少1个是羟基、或者，非取代或具有取代基的C1～C6二烷基氨基，并且R6～R
10
的至少1个是羧基)
[0015]本专利技术提供含L
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生物素的试样的测定方法，其包括将含L
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生物素的试样和上述的L
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生物素测定用试剂混合而调制测定试样的工序，及对测定试样的吸光度进行测定的工序，吸光度的测定值成为试样中的L
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生物素的浓度的指标。
[0016]本专利技术提供被L
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生物素标记的物质的标记数的确定方法，其包括：将含被L
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生物素标记的物质的试样和上述的L
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生物素测定用试剂混合而调制测定试样的工序，对测定试样的吸光度进行测定的工序，基于吸光度的测定值而确定试样中的L
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生物素的浓度的工序，及基于试样中的L
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生物素的浓度及物质的浓度而确定被L
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生物素标记的物质每1分子的L
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生物素基的数的工序。
[0017]本专利技术提供固定化旋光异构性亲和素类的固相的制造方法，包括将从含L
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生物素标记多肽的液体分取的试样和上述的L
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生物素测定用试剂混合而调制测定试样的工序，对测定试样的吸光度进行测定的工序，基于吸光度的测定值而确定测定试样中的L
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生物素的浓度的工序，基于L
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生物素的浓度及多肽的浓度而确定试样中的L
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生物素标记多肽每1分子的L
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生物素基的数的工序，在L
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生物素基的数在指定的范围内时，使液体和能与多肽结合的固相接触而将L
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生物素标记多肽固定化于固相上的工序，及使固定化L
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生物素标记多肽的固相和旋光异构性亲和素类接触，将旋光异构性亲和素类固定化于固相上的工序。
[0018]【专利技术的效果】
[0019]由本专利技术提供能测定试样中的L
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生物素的手段。
[0020]【附图的简单的说明】
[0021]【图1A】是显示处于一试剂的形态的本实施方式的试剂的一例的图。
[0022]【图1B】是显示处于二试剂的形态的本实施方式的试剂的一例的图。
[0023]【图2】是显示使用本实施方式的试剂的L
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生物素测定的原理的图。
[0024]【图3】是显示固定化旋光异构性亲和素类的固相的一例的图。
[0025]【图4A】是使用实施例1的D
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生物素测定用试剂1制成的校准曲线的一例。
[0026]【图4B】是使用实施例1的D
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生物素测定用试剂2制成的校准曲线的一例。
[0027]【图4C】是使用实施例1的L
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生物素测定用试剂制成的校准曲线的一例。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.L
‑
生物素测定用试剂，其含：旋光异构性亲和素类，和由下述的式(I)表示的偶氮苯衍生物：【化1】式中，R1～R
10
各自独立地是选自下列的基团：氢原子、羟基、羧基、非取代或具有取代基的C1～C6二烷基氨基、非取代或具有取代基的C1～C6烷基及非取代或具有取代基的C1～C6烷氧基，但是，R1～R5的至少1个是羟基、或者，非取代或具有取代基的C1～C6二烷基氨基，并且R6～R
10
的至少1个是羧基。2.权利要求1所述的试剂，其中所述旋光异构性亲和素类是如下多肽：具有L型亲和素类的一部分或全部的氨基酸序列，在所述氨基酸序列中甘氨酸以外的氨基酸残基的90％以上是D
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氨基酸残基，与L
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生物素结合，基本上不与D
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生物素结合。3.权利要求1或2所述的试剂，其中所述旋光异构性亲和素类是选自下列的至少1种：旋光异构性链霉亲和素、旋光异构性链霉亲和素修饰体、旋光异构性亲和素、旋光异构性Tamavidin、旋光异构性慢生根瘤亲和素(Bradavidin)及旋光异构性根瘤亲和素(Rhizavidin)。4.权利要求1～3之任一项所述的试剂，其中所述旋光异构性亲和素类是甘氨酸以外的氨基酸残基由D
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氨基酸残基构成的多肽。5.权利要求1～4之任一项所述的试剂，其中所述偶氮苯衍生物是4'
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羟基偶氮苯
‑2‑
羧酸、4'
‑
羟基偶氮苯
‑4‑
羧酸或4'
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二甲基氨基偶氮苯
‑2‑
羧酸。6.含L
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生物素的试样的测定方法，其包括：将含L
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生物素的试样和权利要求1～5之任一项所述的L
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生物素测定用试剂混合而调制测定试样的工序，及对所述测定试样的吸光度进行测定的工序，所述吸光度的测定值成为所述试样中的L
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生物素的浓度的指标。7.权利要求6所述的测定方法，其还包括基于所述吸光度的测定值而确定所述试样中的L
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生物素的浓度的工序。8.被L
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生物素标记的物质的标记数的确定方法，其包括：将含被L
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生物素标记的物质的试样和权利要求1～5之任一项所述的L
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生物素测定用试剂混合而调制测定试样的工序，对所述测定试样的吸光度进行测定的工序，
基于所述吸光度的测定值而确定所述试样中的L
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生物素的浓度的工序，及基于所述试样中的L
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生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：久保卓也，菅沼政俊，石木健吾，
申请(专利权)人：希森美康株式会社，
类型：发明
国别省市：