本发明专利技术提出了一种微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，分析单个血红细胞中半胱氨酸、谷胱甘肽和血红蛋白的含量。采用微流控芯片电泳化学发光检测系统，高压电源有五个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液池Ｂ、样品池Ｓ、废液池ＳＷ、发光试剂池Ｒ及缓冲废液池ＢＷ，微流控芯片置于化学发光检测器的物镜上，化学发光检测器是组合有光电倍增管的倒置显微镜，光电倍增管电连接着数据采集器，数据采集器与计算机电连接。该方法可以通过测定单个血红细胞中谷胱甘肽和半胱氨酸浓度的增加程度，对病变的发生进行早期诊断，分析速度快，灵敏度和分辨率高。适宜于对人体进行健康检查和对病变进行早期诊断，可作为预防医学的有效手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，特别是通过微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞中血红 蛋白(Hb)、谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量的方法。
技术介绍
单细胞分析对于理解许多生理、病理过程以及疾病早期诊断和治疗疾病等具有重要意 义。由于细胞的直径一般为微米级，体积极小，细胞内组分含量非常低(finol-zmol)且极为 复杂，因此检测细胞内超痕量的组分，具有很大难度。微流控芯片电泳(MCE)是继毛细管电泳后发展起来的新分离技术，以其独特的优势被 广泛应用于化学、生物学、医学和环境监测等领域中。微流控芯片具有多通道网络结构，且 通道大小一般为10-100nm，可以进样、反应、分离等操作集成，正因如此，它特别适合于单 细胞分析的要求。微流控芯片电泳具有传统毛细管电泳技术无法比拟的优势，主要包括分离 速度快、分析时间短、可集成化和自动化程度高，容易实现高通量分析。化学发光(CL)是一 种高灵敏的检测技术，已经在化学发光免疫分析，流动注射分析，高效液相色谱和毛细管电 泳中广泛应用，它不需要光源,避免了背景光及瑞利散射等杂散光的干扰,具有仪器结构简单、 操作方便、可与LIF比拟的灵敏度、线性范围宽、分析速度快等优点。正因如此，化学发光 被认为是微流控芯片分析系统最具有潜力的检测技术之一，有利于实现集成化和智能化,能实 现真正意义上的微型化。近年来，MCE-CL联用技术已经应用氨基酸、金属离子、蛋白质以 及免疫测定等分析中，但用于实现单个人血红细胞内物质的分离分析还未见专利和相关文献 报道。目前的研究常采用分析血清中某些蛋白质类标记物来辅助探寻病变，主要基于免疫化学 的方法， 一次只能分析一种标记物，操作繁琐耗时长。另外传统的分析细胞中标记物方法以 大量细胞为前提，获取某一标记物含量的总值，并将该值与细胞数量的比值外推至单细胞内 该标记物的含量。对于性质相对均一的细胞群来说，此方法可以接受，但在另外一些场合下， 比如某些重大疾病的早期阶段，仅有个别细胞的组分发生变化，这时，传统方法将会平均掉 该特异变化。因此，传统方法不适于病变的早期诊断。对正常的健康人来说，单个血红细胞中的谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量很低，差异 较小，分布在一个较窄的范围。当人体的某一部分发生病变时，导致单个血红细胞中谷胱甘 肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)急剧增加。因此，可以通过单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨 酸(Cys)浓度的增加程度，对病变的发生进行早期诊断。
技术实现思路
为了克服目前传统方法分析仪操作繁琐，耗时长，不能进行单细胞分析的不足，本专利技术 提出了一种，分析单个血红细胞中谷 胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量。该方法可以通过单个血红细胞中谷胱甘肽(GSH)和半胱氨 酸(Cys)浓度的增加程度，对病变的发生进行早期诊断，而且分析速度快，灵敏度和分辨率高。 适宜于对人体进行健康检查和对病变进行早期诊断，可作为预防医学的有效手段。本专利技术提供的微流控芯片化学发光测定人单血红细胞内物质的方法，所采用仪器为微流 控芯片电泳化学发光检测系统，高压电源有五个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液 池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废液池BW，微流控芯片置于化学发光检 测器的物镜上，化学发光检测器是组合有光电倍增管的倒置显微镜，光电倍增管电连接着数 据采集器，数据采集器与计算机电连接。所述的微流控芯片采用Y型化学发光检测池的十字型微流控芯片，芯片为一块面积为 9.5x2.5 cm的玻璃/聚二甲基硅氧垸(PDMS)复合薄片，底片为玻璃，盖片为聚二甲基硅氧 垸片，底片刻制有分离通道，盖片设置有缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R 及缓冲废液池BW，盖片设置的缓冲液池B、样品池S、废液池SW、发光试剂池R及缓冲废 液池BW与底片刻制的分离通道相连通，所有通道深度均为15~30pm，通道截面为弧形,有效 分离通道长为5.0~8.0cm，缓冲液池B、样品池S及废液池SW至十字交叉点的距离均为0.5 cm， 发光试剂池R到Y型交叉点的距离为1.5 cm，Y型交叉点到缓冲废液池BW的距离为1.5 cm， Y型交叉点至缓冲液池B、样品池S及废液池SW的通道宽度为40 75pm， Y型交叉点至发 光试剂池R、缓冲废液池BW的通道宽度为100 35(Hun， Y型交叉点至发光试剂池R的通道 为折向通道，从发光试剂池R出发的一段通道的中心线与缓冲液池B至缓冲废液池BW的通 道的中心线平行，这段通道的长度是折向通道总长的三分之二，折向后另外一段至Y型交叉 点的通道的中心线与缓冲液池B至缓冲废液池BW的通道的中心线成45'角。微流控芯片的优选尺寸是所有通道深度均为25 nm，有效分离通道长为6.5cm， Y型交叉点至缓冲液池B、样品池S及废液池SW的通道宽度为60nm， Y型交叉点至发光试剂池R、缓冲废液池BW的通道宽度为300nm。为了确保光电倍增管的工作稳定性，化学发光检测器上的光电倍增管电连接着光电倍增管稳压电源。本专利技术的的测定具体步骤为 A.微流控芯片的预处理微流控芯片的通道依次用0.1 mol/L氢氧化钠溶液，超纯水和 电泳缓冲溶液各冲洗10 min，然后用显微镜观察，在芯片通道中充满电泳缓冲溶液且无细小颗粒和气泡产生；电泳缓冲溶液为含有3.0 mmol/L鲁米诺(luminol)的20 mmol/L硼砂溶液， 其pH,.2;B. 标准血红蛋白、谷胱甘肽和半胱氨酸混合溶液的分析在微流控芯片上的样品池S中 加满混合溶液，其余各个储液池中均加满电泳缓冲液，然后将微流控芯片固定在化学发光检 测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为200 400倍，采用夹流方式进样，在样品池S 上加500~700 V电压,废液池SW接地，同时在缓冲液池B和缓冲废液池BW上分别加150 320 V 和250~500 V电压,发光试剂池R悬浮,进样时间为20 s;之后在缓冲液池B中加2200 2800 V电压, 缓冲废液池BW接地,同时在样品池S和废液池SW都加1200 1800 V电压，发光试剂池R中施加350 600V电压；目镜置于Y型交叉点；然后通过色谱工作站由计算机记录并显示电泳C. 人单个血红细胞内物质的分析在微流控芯片的通道和贮液池都装满电泳缓冲溶液，然后将微流控芯片固定在化学发光检测器的倒置显微镜的载物台上，目镜放大倍数为200~400倍，将样品池S抽空，然后取细胞悬浮液10tiL,用电泳缓冲液稀释至1.5tnL后，用 微量注射器吸取稀释后的细胞悬浮液于样品池S中；将各个贮存池中的液体高度调节为 HS>HB=HBW HSW，在显微镜下观察，当单个细胞由样品池S即将运动到十字交叉点时，立 刻将废液池SW加满缓冲溶液；然后在缓冲液池B中施加80~150 V电压，废液池SW和样 品池S中都施加50 80V电压，缓冲废液池BW接地，而发光试剂池R保持悬浮，且将此组 电压在ls后切断，并重复3-6次；在显微镜下观察，至细胞降沉并贴壁；此后，将发光试剂 池R中的电泳缓冲溶液以氧化试剂溶液代替，并在缓冲液池B和缓冲废液池BW之间施加 2000~3000 V电压，并在ls内切断，重复3-5次；立刻在缓冲液池B中加220本文档来自技高网...
【技术保护点】
微流控芯片化学发光测定人单个血红细胞内物质的方法，其特征在于：所采用仪器为微流控芯片电泳化学发光检测系统，高压电源有五个电源输出端分别连接着微流控芯片的缓冲液池Ｂ、样品池Ｓ、废液池ＳＷ、发光试剂池Ｒ及缓冲废液池Ｂ Ｗ，微流控芯片置于化学发光检测器的物镜上，化学发光检测器是组合有光电倍增管的倒置显微镜，光电倍增管电连接着数据采集器，数据采集器与计算机电连接。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵书林，黄勇，叶芳贵，石明，李向堂，
申请(专利权)人：广西师范大学，
类型：发明
国别省市：45[中国|广西]
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