一种鱼类肝脏类器官扩增培养基及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种鱼类肝脏类器官扩增培养基及其构建方法，属于类器官培养技术领域。本发明专利技术鱼类肝脏类器官扩增培养基包括基础培养基、HEPES缓冲液、抗生素、特异性因子和营养添加剂；所述特异性因子为N

【技术实现步骤摘要】
一种鱼类肝脏类器官扩增培养基及其构建方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养
，尤其涉及一种鱼类肝脏类器官扩增培养基及其构建方法。

技术介绍

[0002]罗非鱼为杂食性鱼类，具有生长快、适应性强、刺少且肉质鲜美等优势，被称为“白色三文鱼”、“21世纪的鱼”，是世界性的主要养殖鱼类。而吉富罗非鱼因其生长迅速、抢食凶猛、群体产量高、抗病性强等优点，已成为中国主要养殖的罗非鱼品种之一。然而，目前在吉富罗非鱼养殖中存在养殖密度大、水体环境欠佳、越冬难等问题，这些都会影响到罗非鱼的养殖效益。为更好地解决这些问题，研究人员通常利用一些血液和肝脏的指标评估鱼体的健康状态，并采取相应措施改善养殖条件。
[0003]肝脏是鱼类的重要器官之一，广泛应用于生理学、药理学和环境毒理学等研究。但动物模型操作复杂、成本高、周期长，且存在个体差异，重复性较差，因此，科学家常用体外培养的肝细胞替代肝脏组织用于生理学和毒理学等研究。原代培养的肝细胞保留体内肝脏的许多重要功能，是体外重要的研究工具之一。但原代肝细胞的结果重复性较差，细胞数量有限，且随着培养时间的延长，肝细胞功能开始迅速退化，最后，肝细胞逐渐脱离培养基质，成纤维样细胞逐渐占据主体，这种现象限制了原代培养的持续时间。细胞系具有良好的重复性，且操作简便，然而和长期培养的原代细胞一样，它也基本丧失了肝脏的特异性功能。
[0004]类器官是近几年广受关注的一种新的体外培养体系。它由干细胞、祖细胞或分化细胞通过细胞间或细胞与基质间相互作用自组织而成，具有与体内来源组织高度相似的结构和功能。由于这一优势，类器官广泛用于生理学、病理学、临床医学等领域，并取得众多突破性成就。但目前几乎所有类器官研究都集中在人类和啮齿类上，鱼类中则鲜有报道。构建鱼类的肝类器官，将弥补类器官在鱼类领域的空白，同时也为鱼类生理学和毒理学研究中的时间依赖性过程、肝细胞的恢复反应及实现动物模型的“3R”原则提供了可能性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种鱼类肝脏类器官扩增培养基及其构建方法。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种鱼类肝脏类器官扩增培养基，其包括基础培养基、HEPES缓冲液、抗生素、特异性因子和营养添加剂；所述特异性因子为N
‑
乙酰半胱氨酸、胃泌素、EGF、HGF、FGF10、Y
‑
27632、A83
‑
01和Wnt3a的混合物。
[0008]本专利技术通过选取基础培养基、HEPES缓冲液、抗生素、特异性因子和营养添加剂搭配，所得鱼类肝脏类器官扩增培养基具有促进类器官生长、维持类器官形态的效果，并且使类器官具有与肝脏组织相似的生物学功能。
[0009]本专利技术的扩增培养基中的基础培养基可以为高糖DEME培养基、DEME/F12培养基、
Advanced DMEM/F12培养基中的任意一种；优选Advanced DMEM/F12培养基作为基础培养基更适合类器官的生长和发育。
[0010]作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲液4
‑
6mM、抗生素溶液1
‑
1.2v/v％、N
‑
乙酰半胱氨酸1
‑
1.5mM、胃泌素8
‑
13nM、EGF 40
‑
60ng/mL、HGF 20
‑
30ng/mL、FGF10 90
‑
110ng/mL、Y
‑
27632 10
‑
14μM、A83
‑
01 5
‑
10μM、Wnt3a 50
‑
100ng/mL。
[0011]在优选配比条件下，本专利技术的培养基在常用的肝脏类器官扩增培养基(EM培养基)的基础上通过添加和剔除不同特异性因子，经过实验发现添加Wnt3a和剔除Rspondin 1得到的培养基对类器官数量和直径更优，并且通过实验发现50
‑
100ng/mL的Wnt3a均能够形成数量和直径较好的鱼类肝脏类器官。
[0012]作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲液5mM、抗生素溶液1
‑
1.2％、N
‑
乙酰半胱氨酸1.1
‑
1.3mM、胃泌素10
‑
13nM、EGF 40
‑
50ng/mL、HGF 25
‑
30ng/mL、FGF10 95
‑
100ng/mL、Y
‑
27632 10
‑
12μM、A83
‑
015
‑
8μM、Wnt3a 50
‑
80ng/mL。
[0013]在优选配比条件下，本专利技术的培养基更适合鱼类肝脏类器官的培养，得到的类器官数量更多，直径更大。
[0014]作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，以所述扩增培养基计，所述抗生素包括100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。本专利技术采用青霉素和链霉素能够有效避免环境中的微生物污染，提高鱼类肝脏类器官的形成效率。
[0015]作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，所述营养添加剂为谷氨酰胺、B27、N2和烟酰胺的混合物。本专利技术选用谷氨酰胺、B27、N2和烟酰胺作为营养添加剂，能够为肝脏细胞发育所需的多种辅酶、维生素、氨基酸、抗氧化剂和脂肪酸，有利于肝脏细胞的生长。
[0016]作为本专利技术所述培养基的优选实施方式，以所述扩增培养基计，所述营养添加剂中包含1v/v％谷氨酰胺、2v/v％B27、1v/v％N2和10mM烟酰胺。
[0017]第二方面，本专利技术提供了一种鱼类肝脏类器官的构建方法，其包括以下步骤：
[0018](1)将鱼类肝脏通过机械破碎及酶解，得到组织碎片，然后过滤、洗涤并重悬，得到肝脏细胞悬液；
[0019](2)将步骤(1)所得肝脏细胞悬液与基质胶溶液混合后孵育至基质胶溶液凝固，加入上述鱼类肝脏类器官扩增培养基培养，得到鱼类肝脏类器官。
[0020]本专利技术构建方法得到的鱼类肝脏类器官具有与肝脏组织相似的结构和生物学功能，能够高水平表达肝脏特有的成熟干细胞相关基因、胆管细胞/祖细胞谱系相关基因以及多能性标记基因，并且在相同逆境下表现出与肝脏组织相似的基因调控，表明本专利技术的鱼类肝脏类器官成功构建。同时，本专利技术提供的构建方法操作简便、安全可靠，可为鱼类生理学和毒理学研究提供新的平台。
[0021]作为本专利技术所述构建方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述机械破碎及酶解的具体步骤为：
[0022]S1、将鱼类肝脏撕成1
‑
5mm3的组织碎片，清洗，再采用切片机以0.5mm单向切割组织碎片，清洗，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鱼类肝脏类器官扩增培养基，其特征在于，包括基础培养基、HEPES缓冲液、抗生素、特异性因子和营养添加剂；所述特异性因子为N
‑
乙酰半胱氨酸、胃泌素、EGF、HGF、FGF10、Y
‑
27632、A83
‑
01和Wnt3a的混合物。2.如权利要求1所述的鱼类肝脏类器官扩增培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲液4
‑
6mM、抗生素溶液1
‑
1.2v/v％、N
‑
乙酰半胱氨酸1
‑
1.5mM、胃泌素8
‑
13nM、EGF 40
‑
60ng/mL、HGF 20
‑
30ng/mL、FGF1095
‑
110ng/mL、Y
‑
27632 10
‑
14μM、A83
‑
01 5
‑
10μM、Wnt3a 50
‑
100ng/mL。3.如权利要求2所述的鱼类肝脏类器官扩增培养基，其特征在于，包括以下组分：基础培养基、HEPES缓冲液5mM、抗生素溶液1v/v％、N
‑
乙酰半胱氨酸1.25
‑
1.5mM、胃泌素10
‑
13nM、EGF 40
‑
50ng/mL、HGF 25
‑
30ng/mL、FGF1095
‑
100ng/mL、Y
‑
27632 10
‑
12μM、A83
‑
01 5
‑
8μM、Wnt3a 50ng/mL。4.如权利要求2或3所述的鱼类肝脏类器官扩增培养基，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文笙，许钰珏，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：