一种人参分生组织细胞快速培养方法及其低温保藏方法技术

本发明专利技术公开了一种人参分生组织细胞(CMCs)快速培养方法及其低温保藏方法；包括：制备人参组织；进行诱导悬浮培养，过滤，去除培养液获得初始人参CMCs；将初始人参CMCs进行悬浮培养，获得大量人参CMCs。本发明专利技术采用直接液体培养，只需要1个月即可获得液体悬浮培养的细胞；采用食品级防腐剂加入培养基中，可有效控制外植体内生菌及培养中染菌问题，同时避免了抗生素的使用，更加适用于不适合添加抗生素的产品。本发明专利技术采用低温冻存的方法对细胞进行保藏，降低了细胞系保藏的成本，同时也避免了多次继代，细胞可能出现的退化变异问题。细胞可能出现的退化变异问题。细胞可能出现的退化变异问题。

【技术实现步骤摘要】
一种人参分生组织细胞快速培养方法及其低温保藏方法


[0001]本专利技术属于植物组织细胞分离方法及冻存领域，涉及一种人参分生组织细胞快速培养方法及其低温保藏方法；具体涉及来自人参根分生组织的植物细胞系及其分离方法，以及其低温保藏方法；该细胞系从人参根分生组织得到，不需要固体培养步骤，该低温保藏方法可以长期低温保存。

技术介绍

[0002]人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物。人参的化学成分主要包括人参皂苷(如，Ra、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、Rh2、Ro等)、蛋白质、挥发油、多胺、低分子肽等。目前人参主要以种子繁殖为主，从栽培到采收需要5
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6年的时间。并且人参种子由于其生理后熟的特点，需要经历长时间的沙藏才能发芽，进一步加长了人参的繁殖周期。与此同时，人参有着严重的连作障碍，无法长期在固定地点大面积种植，需要在一个栽培周期后(一般5
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6年)后经过30
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60年的生态修复才能继续栽培。因此，需要大量的人力物力成本。
[0003]植物分生组织细胞(Cambial meristematic cells，CMCs)又称为植物干细胞(Plant Stem Cells)，是相对于植物体内已经分化的成熟组织而言的，是植物体内未分化的细胞。能持续或周期性地进行细胞分裂，具有高度的再生能力，是植物生命力的起源。
[0004]自1960年以来，对人参愈伤组织，人参不定根、毛状根进行了大量研究。虽然这些研究在一定程度上弥补了人参栽培过程中的缺点，但是依然无法保证遗传稳定性，并且次生代谢产物的含量非常低，有的几乎没有。2010年Lee成功诱导分离了植物体中未分化的细胞(红豆杉和人参)(Lee Eun
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Kyong,Jin Young
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Woo,Park Joong Hyun,et al.Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products[J].Nature Biotechnology,2010,28(11):1213
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1217.)。韩国云火公司也研发了从草本植物形成层分离未分化细胞的方法。研究显示，植物未分化的细胞主要分布在分生组织中。目前，分生组织的细胞培养成功的有红豆杉、番茄、人参、银杏、水稻和玉米等。然而，现有这些分离未分化细胞的技术往往需要经历固体诱导和增殖培养，再过渡到液体悬浮培养，一般需要3
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4个月才能实现液体悬浮培养；同时需要将抗生素添加入培养基中，进而控制外植体中内生菌和培养中染菌问题；对植物干细胞系的保藏主要通过长期继代保藏，需要消耗大量的人力物力，同时细胞还可能出现退化变异等问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是针对上述现有技术存在的不足，提供一种人参分生组织细胞快速培养方法及其低温保藏方法。
[0006]本专利技术的目的通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供了一种人参CMCs快速培养方法，所述方法包括如下步骤：
[0008]S1、制备人参组织；
[0009]S2、对所述人参组织进行诱导悬浮培养，过滤，去除培养液获得初始人参CMCs；
[0010]S3、将所述初始人参CMCs进行悬浮培养，获得人参CMCs。
[0011]作为本专利技术的一个实施方案，所述诱导悬浮培养基是在液态基础培养基中添加IAA 0.5
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10mg/L、IBA 0.5
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10mg/L、L
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抗坏血酸50
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100mg/L、柠檬酸100
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150mg/L、苯甲酸钠0.5
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10g/L；所述液态基础培养基为B5、MS或WPM。在一些实施例中，诱导悬浮培养基是在B5液态基础培养基中添加IAA 2.5mg/L、IBA 2.5mg/L、L
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抗坏血酸100mg/L、柠檬酸150mg/L、苯甲酸钠2g/L。
[0012]作为本专利技术的一个实施方案，所述诱导悬浮培养条件为：22
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30℃、50
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100r/min振荡、黑暗培养10
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20d。在一些实施例中，诱导悬浮培养条件为：24.6℃、100r/min振荡、黑暗培养14d。
[0013]作为本专利技术的一个实施方案，所述悬浮培养是在液态基础培养基中添加IAA 0.5
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10mg/L、IBA 0.5
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10mg/L、NAA 0.5
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10mg/L、复硝酚钠0.5
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10mg/L、L
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抗坏血酸50
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100mg/L、柠檬酸100
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150mg/L、苯甲酸钠0.5
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10g/L；所述液态基础培养基为B5、MS或WPM。在一些实施例中，悬浮培养是在B5液态基础培养基中添加IAA 2.9mg/L、IBA 2.6mg/L、NAA 5.9mg/L、复硝酚钠5mg/L、L
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抗坏血酸100mg/L、柠檬酸150mg/L、苯甲酸钠2g/L。
[0014]作为本专利技术的一个实施方案，所述悬浮培养的条件为：22
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30℃、50
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200r/min振荡、黑暗培养，每10
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20天继代一次。在一些实施例中，悬浮培养的条件为：24.6℃、100r/min振荡、黑暗培养，每11天继代一次。进一步的，悬浮培养后过滤，去除培养液获得CMCs。
[0015]前述方法获得的人参CMCs也属于本专利技术的保护范围。
[0016]本专利技术还提供一种人参CMCs的低温保藏方法，所述方法包括如下步骤：
[0017]A1、预处理：取处于对数生长期的所述人参CMCs，离心去上清，加入冻存液剂，混匀后暗培养1
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5天；
[0018]A2、冷冻保存：将预处理后的细胞进行沉降处理，去除冻存液剂；加入冷冻保护剂孵育后，先在
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(10
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20)℃放置0.5
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3h，再放到
‑
(70
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80)℃进行保存。在一些实施例中，加入冷冻保护剂孵育后，先在
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20℃放置40min，再放到
‑
80℃进行保存。
[0019]作为本专利技术的一个实施方案，所述冻存液剂中含蔗糖0
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1mol/L、山梨醇0
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1mol/L、甘油0
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1mol/L。蔗糖、山梨醇和甘油含量不同时为0。可以为含蔗糖0.1
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1mol/L、山梨醇0.1
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1mol本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人参分生组织细胞CMCs快速培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、制备人参组织；S2、对所述人参组织进行诱导悬浮培养，过滤，去除培养液获得初始人参CMCs；S3、将所述初始人参CMCs进行悬浮培养，获得大量人参CMCs。2.根据权利要求1所述的人参分生组织细胞快速培养方法，其特征在于，所述诱导悬浮培养基是在液态基础培养基中添加IAA 0.5
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10mg/L、IBA 0.5
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10mg/L、L
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抗坏血酸50
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100mg/L、柠檬酸100
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150mg/L、苯甲酸钠0.5
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10g/L；所述液态基础培养基为B5、MS或WPM。3.根据权利要求1或2所述的人参分生组织细胞快速培养方法，其特征在于，所述诱导悬浮培养条件为：22
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30℃、50
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100r/min振荡、黑暗培养10
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20d。4.根据权利要求1所述的人参分生组织细胞快速培养方法，其特征在于，所述悬浮培养是在液态基础培养基中添加IAA 0.5
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10mg/L、IBA 0.5
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10mg/L、NAA 0.5
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10mg/L、复硝酚钠0.5
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10mg/L、L
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抗坏血酸50
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100mg/L、柠檬酸100
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150mg/L、苯甲酸钠0.5
‑
10g/L；所述液态基础培养基为B5、MS或WPM。5.根据权利要求1或4所述的人参分生组织细胞快速培养方法，其特征在于，所述悬浮培养的条件为：22
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30℃、50
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200r/min振荡、黑暗培养，每10
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20天继代一次。6.一种根据权利要求1
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5中任一项所述方法获得的人参CMCs。7.一种如权利要求6所述的人参CMC...

【专利技术属性】
技术研发人员：金司阳，刘青，杨继峰，王吉超，高雅，伍承龙，
申请(专利权)人：上海珈凯生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：