一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，本发明专利技术所提供的重组大肠杆菌经过连续化发酵，具有发酵产量高，周期短的特点，在生产中有较好的应用价值。在生产中有较好的应用价值。在生产中有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于生物领域，具体涉及一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]苏氨酸(L
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threonine)是人体所必需的八种氨基酸中的之一。苏氨酸在人体内和动物体内不能合成，但是在生命过程中发挥重要的作用。现如今，L
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苏氨酸已经成为了继甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸以外第四种重要的氨基酸。在食品产业、医疗制药行业和化妆品行业中L
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苏氨酸已被广泛应用，需求量逐年增加。在食品行业中，L
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苏氨酸作为一种食品添加剂，主要用作食品强化剂，提高食品中的营养成分，补充被破坏的营养元素，同时，L
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苏氨酸用于人们常食用的糕点、乳化食品和牛奶之中，发挥抗氧化作用，并且L
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苏氨酸与葡萄糖可以发生反应产生巧克力香味和焦香味道，可以用作食品的增香剂。L
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苏氨酸在医疗行业领域中可以存进T淋巴细胞成熟发育，也可以提高人体免疫功能。L
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苏氨酸除了是重要的食品强化剂外，也是一种重要的饲料添加剂，主要添加到家禽和猪饲料之中。
[0003]L
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苏氨酸是人体最重要的氨基酸之一，它的需求是由于其在食品，化学和制药行业的广泛应用而急剧增加。目前，微生物发酵已广泛用于工业以大肠杆菌为最佳候选菌株生产L
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苏氨酸。然而，L
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苏氨酸发酵已在单批次游离发酵中进行，发酵后不能重复使用的模式。批量发酵和一次性使用细胞会增加操作成本并降低生产率。同时，分散在发酵培养基中的游离细胞在有氧发酵过程中受到应力条件(例如剪切力)的挑战，导致在发酵过程中细胞活力降低。基于生物膜的固定发酵具有更高的代谢活性以及细胞重复利用以达到节约成本。
[0004]细菌可以通过产生细胞间聚集和表面粘附因子从单细胞(浮游)模式切换到多细胞群落(生物膜)模式。有证据表明CsgD蛋白调节rpoS(sigma(S))调节子的表达。转录因子CsgD通过控制curli和其他生物膜成分的产生，在控制大肠杆菌生物膜形成中起关键作用。CsgD调节20多个靶基因，包括编码Curli操纵子的csg操纵子。大肠杆菌的curli和纤维素是主要生物膜成分。它们的表达需要CsgD转录因子。复杂的调控网络允许对csgD转录和生物膜形成进行环境控制。csgD可作为curli合成相关基因的转录调节因子，调节curli合成的中心物质及骨架蛋白csgA和csgB转录表达，从而对生物膜的形成造成影响。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述过表达csgD基因的重组大肠杆菌的构建方法。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述过表达csgD基因的重组大肠杆菌的应用。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了如下技术。
[0009]第一方面，本专利技术公开了一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌过表达csgD基因。
[0010]其中，所述大肠杆菌为W1688ΔycgF；所述csgD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]第二方面，本专利技术公开了上述过表达csgD基因的重组大肠杆菌的构建方法。
[0012]所述构建方法包括如下步骤：
[0013](1)扩增目的基因csgD：以E.coli W1688ΔycgF基因组作为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的csgD
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F、csgD
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R为引物进行PCR扩增；
[0014](2)从E.coli DH5α甘油菌中提取质粒Pcwj，通过酶切对质粒进行线性化；
[0015](3)将步骤(1)扩增所得目的基因csgD与步骤(2)所得线性化质粒一步克隆，构建重组质粒Pcwj
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csgD；
[0016](4)将步骤(3)所得重组质粒Pcwj
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csgD转化至W1688ΔycgF感受态中，即得过表达菌株E.coli W1688ΔycgF+csgD。
[0017]第三方面，本专利技术公开了上述所述重组大肠杆菌在发酵产L
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苏氨酸中的应用。
[0018]其中，所述重组大肠杆菌按照5％～15％的体积比接种到发酵培养基中发酵产L
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苏氨酸，优选为所述重组大肠杆菌按照8％～12％的体积比接种到发酵培养基中发酵产L
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苏氨酸，进一步优选为所述重组大肠杆菌按照10％的体积比接种到发酵培养基中发酵产L
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苏氨酸。
[0019]其中，所述发酵的培养基包括葡萄糖、酵母粉、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4·
7H2O、FeSO4·
7H2O、MnSO4·
5H2O、CaCO3。其中，所述发酵培养基中各组分的浓度为25～35g/L葡萄糖，0.1～4g/L酵母粉，0.1～2g/L KH2PO4，15～25g/L(NH4)2SO4，0.4～1.2g/LMgSO4·
7H2O，0.01～0.4g/L FeSO4·
7H2O，0.01～0.4g/L MnSO4·
5H2O，10～20g/L CaCO3，优选为28～32g/L葡萄糖，1～3g/L酵母粉，0.5～1.5g/L KH2PO4，18～22g/L(NH4)2SO4，0.6～1g/L MgSO4·
7H2O，0.1～0.3g/L FeSO4·
7H2O，0.1～0.3g/L MnSO4·
5H2O，13～17g/LCaCO3，进一步优选为30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/L KH2PO4，20g/L(NH4)2SO4，0.8g/L MgSO4·
7H2O，0.2g/L FeSO4·
7H2O，0.2g/L MnSO4·
5H2O，15g/L CaCO3。
[0020]其中，所述发酵为游离发酵或固定化发酵，优选为固定化发酵，进一步优选为固定化连续发酵。
[0021]其中，所述固定化发酵或固定化连续发酵中载体为聚合物多孔泡沫和/或棉纤维材料。
[0022]其中，所述固定化载体的用量为10～50g/L，优选为20～40g/L，进一步优选为30g/L。
[0023]其中，所述发酵的温度为20～50℃，优选为30～44℃，进一步优选为37℃。
[0024]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：
[0025]本专利技术通过构建一株过表达csgD基因的重组大肠杆菌，经过连续化发酵，具有发酵产量高，周期短的特点，在生产中有较好的应用价值。
附图说明
[0026]下面结合附图和具体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌过表达csgD基因。2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌为W1688ΔycgF；所述csgD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.权利要求1或2所述重组大肠杆菌在发酵产L
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苏氨酸中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌按照5％～15％的体积比接种到发酵培养基中发酵产L
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苏氨酸，优选为所述重组大肠杆菌按照8％～12％的体积比接种到发酵培养基中发酵产L
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苏氨酸，进一步优选为所述重组大肠杆菌按照10％的体积比接种到发酵培养基中发酵产L
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苏氨酸。5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述发酵的培养基包括葡萄糖、酵母粉、KH2PO4、(NH4)2SO4、MgSO4·
7H2O、FeSO4·
7H2O、MnSO4·
5H2O、CaCO3。6.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述发酵培养基中各组分的浓度为25～35g/L葡萄糖，0.1～4g/L酵母粉，0.1～2g/L KH2PO4，15～25g/L(NH4)2SO4，0.4～1.2g/LMgSO4·
7H2O，0.01～0.4g/L FeSO4·

【专利技术属性】
技术研发人员：孙文俊，祁文露，陈勇，石书琪，李国雄，张凯杰，陈天鹏，余斌，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：