产2'-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了产2'

【技术实现步骤摘要】
产2
’‑
岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于合成生物学
，具体涉及产2
’‑
岩藻糖基乳糖重组大肠杆菌的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]母乳作为婴幼儿的最佳食物具有配方奶粉和牛乳不可代替的营养价值，其中最大的差异在于母乳中寡糖的种类和含量。人乳寡糖(human milk oligosac
‑
charides，HMOs)是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大固体成分，含量大约在5
‑
15g/L。在HMOs中，2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
’‑
fucosyllactose，2
’‑
FL)含量最高，达31％。越来越多的证据表明2
’‑
FL具有许多有益于婴幼儿的功能活性，包括益生元活性、防止病原体粘附、肠上皮细胞反应的调节剂、免疫调节剂、预防坏死性小肠结肠炎和促进大脑发育等。正是2
’‑
FL诸多的生理功能，美国、欧盟、加拿大、澳大利亚、新西兰等国家和地区先后批准2
’‑
FL作为新食品原料。
[0003]2’‑
FL的主要获取方法有从母乳中提取、化学合成、酶法合成和微生物合成。相比于其他三种方法，微生物合成法更具有经济性和高效性。2
’‑
FL的微生物合成是在α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶的作用下，将岩藻糖基从GDP
‑
L<br/>‑
岩藻糖转移到乳糖上。GDP
‑
L
‑
岩藻糖作为合成2
’‑
FL的供体，目前有两种不同的合成途径：从头合成途径和补救合成途径。从头合成途径涉及磷酸甘露糖变位酶ManB，甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶ManC，GDP
‑
甘露糖
‑6‑
脱氢酶Gmd和GDP
‑
L
‑
岩藻糖合成酶WcaG的过表达。这些酶基因的过量表达会打破宿主的代谢平衡，影响菌体生长，限制GDP
‑
L
‑
岩藻糖和2
’‑
FL产量的进一步提高。葡萄糖或甘油作为底物的成本较为低廉，但是从头合成途径催化步骤较长造成代谢通量和中间产物的流失，最终产率相对较低。而补救合成途径仅需过表达L
‑
岩藻糖
‑
激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶Fkp，以L
‑
岩藻糖为起始底物对菌体的代谢影响较低。
[0004]目前已经研发了大肠杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒状杆菌等生产2
’‑
FL的宿主。大肠杆菌背景清晰、载体受体系统完备、生长迅速、培养简单等特点，是目前合成2
’‑
FL研究最多的宿主。在大肠杆菌中，敲除β
‑
半乳糖苷酶基因LacZ、UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶基因WcaJ和岩藻糖异构酶/墨角藻糖激酶基因FucI
‑
FucK基因簇，调控ManB、ManC、Gmd、WacG、Fkp和FucT2的表达强度并优化发酵条件，摇瓶水平上2
’‑
FL的产量为3.81g/L(沐万孟等，CN110804577A)。在低pH培养条件下促进大肠杆菌S17
‑
3可拉酸的合成，GDP
‑
L
‑
岩藻糖是合成可拉酸的关键前体物质，通过敲除WcaJ来阻断可拉酸的合成，从而提高胞内GDP
‑
L
‑
岩藻糖的积累。在此基础上，异源表达α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶，重组菌S17
‑
3产生0.62g/L的2
’‑
FL(孙俊松等，CN111218488A；Chen Q,et al.(2020)“Engineering a colanic acid biosynthesis pathway in E.coli for manufacturing 2
’‑
fucosyllact ose”.Process Biochem 94:79
‑
85.)。增加岩藻糖基转移酶的可溶性表达也是提高2
’‑
FL产量的一个重要方面。采用柔性linker将4种不同的融合蛋白标签融合在FutC的N端，从而提高了FutC的可溶性和生物活性，摇瓶发酵2
’‑
FL产量从1.71g/L增加到2.94g/L(刘龙等，CN112322565A)。
[0005]迄今已对2
’‑
FL的合成做出了许多努力，但大肠杆菌合成2
’‑
FL的产量仍不高，底
物乳糖和岩藻糖的转化效率较低，2
’‑
FL的生产成本高。因此，利用合成生物学手段，构建高效合成2
’‑
FL的重组微生物对本领域来将具有重大意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种高效生产2
’‑
岩藻糖基乳糖重组微生物，尤其是大肠杆菌。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了重组微生物。
[0008]所述重组大肠杆菌为下述A5)、A4)、A3)、A2)或A1)：
[0009]A1)所述重组大肠杆菌含有G1基因，所述G1基因为α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因和L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶基因；
[0010]A2)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因，所述重组大肠杆菌不含有K1基因，所述K1基因为β
‑
半乳糖苷酶基因、UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶基因、岩藻糖异构酶基因、墨角藻糖激酶基因、阿拉伯糖异构酶基因和鼠李糖异构酶基因这6种基因中的6种、5种、4种、3种、2种或1种；
[0011]A3)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因，不含有所述K1基因，所述重组大肠杆菌含有G2基因，所述G2基因为岩藻糖转运蛋白基因和/或乳糖通透酶基因；
[0012]A4)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因和所述G2基因，不含有所述K1基因和外膜脂质合成和修饰相关的基因；
[0013]A5)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因和所述G2基因，不含有所述K1基因、外膜脂质合成和修饰相关的基因和外膜脂多糖合成、修饰和/或转运相关的基因。
[0014]上述重组大肠杆菌可表达所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因和L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶基因。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌为下述A5)、A4)、A3)、A2)或A1)：A1)所述重组大肠杆菌含有G1基因，所述G1基因为α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶基因和L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶基因；A2)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因，所述重组大肠杆菌不含有K1基因，所述K1基因为β
‑
半乳糖苷酶基因、UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶基因、岩藻糖异构酶基因、墨角藻糖激酶基因、阿拉伯糖异构酶基因和鼠李糖异构酶基因这6种基因中的6种、5种、4种、3种、2种或1种；A3)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因，不含有所述K1基因，所述重组大肠杆菌含有G2基因，所述G2基因为岩藻糖转运蛋白基因和/或乳糖通透酶基因；A4)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因和所述G2基因，不含有所述K1基因和外膜脂质合成和修饰相关的基因；A5)所述重组大肠杆菌含有所述G1基因和所述G2基因，不含有所述K1基因、外膜脂质合成和修饰相关的基因和外膜脂多糖合成、修饰和/或转运相关的基因。2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶来源于幽门螺杆菌、大肠杆菌、脆弱拟杆菌或细长嗜热聚球藻；和/或，所述L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶来源于脆弱拟杆菌；和/或，所述岩藻糖转运蛋白来源于大肠杆菌；和/或，所述乳糖通透酶来源于大肠杆菌。3.如权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述外膜脂质合成和修饰相关基因为LpxL基因、LpxM基因、LpxP基因和LpxT基因中的至少一种；和/或，所述外膜脂多糖合成、修饰和/或转运相关基因为WaaF基因、WaaL基因、WaaV基因、WaaW基因、WaaY基因、WaaT基因、WaaO基因、WaaP基因、WaaG基因和WaaQ基因中的至少一种。4.如权利要求1
‑
3中任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述β
‑
半乳糖苷酶为下述任一种蛋白质：H1)氨基酸序列是GenBank为ACT42197.1所示的蛋白质；H2)将H1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与H1)的蛋白质具有80％以上的同一性且具有β
‑
半乳糖苷酶活性的蛋白质；H3)在H1)或H2)的N端和/或C端连接标签得到的具有β
‑
半乳糖苷酶活性的融合蛋白质；和/或，所述UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶为下述任一种蛋白质：J1)氨基酸序列是GenBank为ACT43804.1所示的蛋白质；J2)将J1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与J1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶活性的蛋白质；J3)在J1)或J2)的N端和/或C端连接标签得到的具有UDP
‑
葡萄糖脂质载体转移酶活性的融合蛋白质；和/或，所述岩藻糖异构酶为下述任一种蛋白质：K1)氨基酸序列是GenBank为ACT44469.1所示的蛋白质；K2)将K1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与K1)所示的蛋
白质具有80％以上的同一性且具有岩藻糖异构酶活性的融合蛋白质；K3)在K1)或K2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；和/或，墨角藻糖激酶为下述任一种蛋白质：L1)氨基酸序列是GenBank为ACT44470.2所示的蛋白质；L2)将L1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与L1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有墨角藻糖激酶活性的蛋白质；L3)在L1)或L2)的N端和/或C端连接标签得到的具有墨角藻糖激酶活性的融合蛋白质；和/或，阿拉伯糖异构酶为下述任一种蛋白质：M1)氨基酸序列是GenBank为ACT41965.1所示的蛋白质；M2)将M1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与M1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具阿拉伯糖异构酶活性的蛋白质；M3)在M1)或M2)的N端和/或C端连接标签得到的具有阿拉伯糖异构酶活性的融合蛋白质；和/或，鼠李糖异构酶为下述任一种蛋白质：N1)氨基酸序列是GenBank为ACT45582.2所示的蛋白质；N2)将N1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与N)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有鼠李糖异构酶活性的蛋白质；N3)在N1)或N2)的N端和/或C端连接标签得到的具有鼠李糖异构酶活性的融合蛋白质；和/或，来源于脆弱拟杆菌的L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶为下述任一种蛋白质：O1)氨基酸序列是序列序列SEQ ID NO.1所示的蛋白质；O2)将O1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与O1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶活性的蛋白质；O3)在O1)或O2)的O端和/或C端连接标签得到的具有L
‑
岩藻糖激酶/GDP
‑
L
‑
岩藻糖焦磷酸化酶活性的融合蛋白质；和/或，来源于幽门螺杆菌的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶为下述任一种蛋白质：P1)氨基酸序列是序列SEQ ID NO.2所示的蛋白质；P2)将P1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与P)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；P3)在P1)或P2)的P端和/或C端连接标签得到的具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的融合蛋白质；和/或，来源于大肠杆菌的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶为下述任一种蛋白质：Q1)氨基酸序列是序列SEQ ID NO.3所示的蛋白质；Q2)将Q1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Q)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；Q3)在Q1)或Q2)的Q端和/或C端连接标签得到的具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的融合蛋白质；和/或，来源于脆弱拟杆菌的α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶为下述任一种蛋白质：
R1)氨基酸序列是序列序列SEQ ID NO.4所示的蛋白质；R2)将R1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与R)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的蛋白质；R3)在R1)或R2)的R端和/或C端连接标签得到的具有α
‑
1,2
‑
岩藻糖基转移酶活性的融合蛋白质；和/或来源于细长嗜热聚球藻菌的α
‑
1,2
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岩藻糖基转移酶为下述任一种蛋白质：S1)氨基酸序列是序列SEQ ID NO.5所示的蛋白质；S2)将S1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与S)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功的蛋白质；S3)在S1)或S2)的S端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；和/或，乳糖通透酶为下述任一种蛋白质：T1)氨基酸序列是GenBank为NP_414877.1所示的蛋白质；T2)将T1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与T)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有乳糖通透酶活性的蛋白质；T3)在T1)或T2)的T端和/或C端连接标签得到的具有乳糖通透酶活性的融合蛋白质；和/或，岩藻糖转运蛋白为下述任一种蛋白质：U1)氨基酸序列是序列GenBank为NP_417281.1所示的蛋白质；U2)将U1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与U)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有岩藻糖转运蛋白活性的蛋白质；U3)在U1)或U2)的U端和/或C端连接标签得到的具有岩藻糖转运蛋白活性的融合蛋白质；和/或，所述LpxL基因编码的蛋白质如下述任一种：V1)氨基酸序列是GenBank为ACT42945.1所示的蛋白质；V2)将V1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与V)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂质合成和修饰相关活性的蛋白质；V3)在V1)或V2)的V端和/或C端连接标签得到的具有外膜脂质合成和修饰相关活性的融合蛋白质；和/或，所述LpxM基因编码的蛋白质如下述任一种：W1)氨基酸序列是GenBank为ACT43680.1所示的蛋白质；W2)将W1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与W)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂质合成和修饰相关活性的蛋白质；W3)在W1)或W2)的W端和/或C端连接标签得到的具有外膜脂质合成和修饰相关活性的融合蛋白质；和/或，所述LpxP基因编码的蛋白质如下述任一种：X1)氨基酸序列是GenBank为ACT44109.1所示的蛋白质；X2)将X1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与X)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂质合成和修饰相关活性的蛋白质；X3)在X1)或X2)的X端和/或C端连接标签得到的具有外膜脂质合成和修饰相关活性的融合蛋白质；
和/或，所述LpxT基因编码的蛋白质如下述任一种：Y1)氨基酸序列是GenBank为ACT43927.1所示的蛋白质；Y2)将Y1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Y)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂质合成和修饰相关活性的蛋白质；Y3)在Y1)或Y2)的Y端和/或C端连接标签得到的具有外膜脂质合成和修饰相关活性的融合蛋白质；和/或，所述WaaF基因编码的蛋白质如下述任一种：Z1)氨基酸序列是GenBank为ACT45276.1所示的蛋白质；Z2)将Z1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Z)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂多糖合成和修饰相关活性的蛋白质；Z3)在Z1)或Z2)的Z端和/或C端连接标签得到的具有外膜脂多糖合成和修饰相关活性的融合蛋白质；和/或，所述WaaL基因编码的蛋白质如下述任一种：Z1)氨基酸序列是GenBank为ACT45278.1所示的蛋白质；Z2)将Z1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与Z)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂多糖合成和修饰相关活性的蛋白质；Z3)在Z1)或Z2)的Z端和/或C端连接标签得到的具有外膜脂多糖合成和修饰相关活性的融合蛋白质；和/或，所述WaaV基因编码的蛋白质如下述任一种：T1)氨基酸序列是GenBank为ACT45279.1所示的蛋白质；T2)将T1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与T)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有外膜脂多糖合成和修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：江正强，梁山泉，杨绍青，何滋，闫巧娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：