产泰乐菌素类似物的工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种产泰乐菌素类似物的工程菌及其构建方法与应用。所述产泰乐菌素类似物的工程菌为tylR1和tylR2基因表达强化的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。本发明专利技术利用链霉菌看家基因hrdB的启动子(P

【技术实现步骤摘要】
产泰乐菌素类似物的工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于微生物工程
，具体地说，涉及一种产泰乐菌素类似物的工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]链霉菌属于放线菌门和链霉菌属的革兰氏阳性细菌，广泛分布于具有丰富有机质、含水量适中的中性或者偏碱性土壤环境中。链霉菌除了具有复杂的发育分化周期外，还能够产生丰富的、种类繁多的次级代谢产物，这些次级代谢产物，如抗生素，抗癌剂，驱虫剂，免疫抑制剂，色素和其他生物活性物质等，有些化合物在医疗、农业、畜牧业等方面具有重要的应用价值。
[0003]圈卷产色链霉菌7100(Streptomyces ansochromogenes 7100)是从我国东北土壤中分离得到的。在MS培养基培养条件下，对全局性调控基因wblA敲除可激活一种新型泰乐菌素类似物1、2、3(tylosin analogue compounds 1、2、3，全称为TACs，单个化合物分别称为TAC1,TAC2,TAC3)的生物合成，其抗肺炎链球菌的活性比泰乐菌素高出近15倍，而另一种原本产生的尼可霉素则不再合成。
[0004]泰乐菌素类似物1、2、3与泰乐菌素的结构类似，它们的主骨架是由乙酰辅酶A，甲基丙二酰辅酶A，乙基丙二酰辅酶A和丙二酰辅酶A组装而成，内酯环上再连接6
‑
脱氧
‑
D
‑
阿洛糖(Mycinose)。而泰乐菌素除含有阿洛糖外还含有碳霉氨基糖(Mycaminose)和红霉糖(Mycarose)，主骨架略有差别。TAC1的C5，C6来自丙二酰辅酶A，TAC2及其同分异构体TAC3的C5，C6，C19，C20来自乙基丙二酰辅酶A(图1)。
[0005]泰乐菌素类似物生物合成基因簇和已知的S.eurythermus ATCC23956中安哥拉霉素(angolamycin)生物合成基因簇的序列一致性高达99％，包含负责16元环合成的I型聚酮合成酶基因，由五个基因(pks1
‑
5)组成一个转录单元，两侧的糖苷合成酶基因以及两个调控基因—tylR1和tylR2(图2)。目前，尚未见基因tylR1和tylR2在调控泰乐菌素类似物生物合成方面的相关研究报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种产泰乐菌素类似物的工程菌及其构建方法与应用。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种产泰乐菌素类似物的工程菌，其为tylR1和tylR2基因表达强化的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)。
[0008]所述泰乐菌素类似物为化合物1、2、3，它们的结构如下：
[0009][0010]其中，化合物2、3为同分异构体。
[0011]tylR1基因的核苷酸序列为：
[0012]i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
[0013]ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0014]iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0015]iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0016]tylR2基因的核苷酸序列为：
[0017]I)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
[0018]II)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0019]III)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0020]IV)与I)、II)或III)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0021]优选地，出发菌株为圈卷产色链霉菌7100。
[0022]第二方面，本专利技术提供一种产泰乐菌素类似物工程菌的构建方法，利用基因工程手段，增强圈卷产色链霉菌中的基因tylR1和tylR2的高表达。
[0023]所述增强的途径选自以下1)～5)，或任选的组合：
[0024]1)通过导入具有所述基因的质粒而增强表达；
[0025]2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强表达；
[0026]3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强表达；
[0027]4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强表达；
[0028]5)通过导入增强子而增强表达。
[0029]进一步地，通过将调控基因tylR1和tylR2自身的启动子替换为强启动子，从而实
现基因的增强表达。
[0030]所述强启动子可选自启动子P
hrdB
、P
ermE*
或P
kasO*
等，优选启动子P
hrdB
，其序列如SEQ ID NO:1所示。
[0031]本专利技术中，强启动子引入的方法包括但不限于无痕敲入法、重组质粒不同拷贝数复制法、重组质粒整合法。
[0032]进一步地，所述工程菌的构建方法包括：分别构建由启动子P
hrdB
驱动的调控基因tylR1表达盒以及由启动子P
hrdB
驱动的基因tylR2表达盒，将两个表达盒构建到质粒上，所得重组质粒导入圈卷产色链霉菌中，筛选阳性转化子。
[0033]所述质粒可选自pSET152、pKC1139或pIJ10500等，优选pSET152。
[0034]优选地，出发菌株为圈卷产色链霉菌7100。
[0035]第三方面，本专利技术提供按照所述方法构建得到的产泰乐菌素类似物的工程菌。
[0036]第四方面，本专利技术提供所述工程菌在泰乐菌素类似物发酵生产中的应用。
[0037]第五方面，本专利技术提供一种生产泰乐菌素类似物的方法，所述方法包括：
[0038]a)培养所述产泰乐菌素类似物的工程菌，以获得所述工程菌的培养物；
[0039]b)从步骤a)中获得的培养物中收集所产生的泰乐菌素类似物。
[0040]第六方面，本专利技术提供圈卷产色链霉菌中的基因tylR1和tylR2在正调控泰乐菌素类似物生物合成中的应用。
[0041]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0042]本专利技术利用链霉菌看家基因hrdB的启动子(启动子P
hrdB
)驱动泰乐菌素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产泰乐菌素类似物的工程菌，其特征在于，其为tylR1和tylR2基因表达强化的圈卷产色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)；所述泰乐菌素类似物为化合物1、2、3，它们的结构如下：其中，化合物2、3为同分异构体；tylR1基因的核苷酸序列为：i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；tylR2基因的核苷酸序列为：I)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；II)SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；III)在严格条件下与SEQ ID NO:3所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1
×
SSPE或含0.1％SDS的0.1
×
SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或IV)与I)、II)或III)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，出发菌株为圈卷产色链霉菌7100。3.产泰乐菌素类似物工程菌的构建方法，其特征在于，利用基因工程手段，增强圈卷产色链霉菌中的基因tylR1和tylR2的高表达；所述增强的途径选自以下1)～5...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭华荣，李月，李敬敬，郑家珍，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：