基于fimC基因敲除的哈维弧菌高接合转移效率菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了基于fimC基因敲除的哈维弧菌高接合转移效率菌株及其构建方法和应用。是将哈维弧菌的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC敲除，所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp

【技术实现步骤摘要】
基于fimC基因敲除的哈维弧菌高接合转移效率菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及基于fimC基因敲除的哈维弧菌高接合转移效率菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]哈维弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖生物的重要条件致病菌，对海水养殖产业造成了巨大的危害。华南沿海海水鱼病害调查发现，海水鱼类弧菌病约70％为哈维弧菌所致。由于疫苗和免疫增强剂等其他控制方法的局限性，抗生素被认为是对抗细菌性传染病最有效、最灵活的武器，被广泛用于预防或治疗水产养殖中的细菌性疾病。目前，哈维弧菌的耐药形势严峻，耐药指数高达0.60。因此，阐明其致病机制和耐药机制并制备相关疫苗，进行免疫防控迫在眉睫。
[0003]致病机制和耐药机制研究以及减毒活疫苗等的研发通常涉及基因敲除的基因工程操作。但是，传统的使用大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细菌携带外源基因，并与受体菌接合转移实现外源载体进入受体细胞内，并进一步发生同源重组进行基因敲除的方法，在哈维弧菌中因接合转移成功率极低，甚至不能成功转移，而受到阻碍，这限制了该菌的遗传学研究。
[0004]基于以上问题，该专利专利技术构建了一株高接合转移效率的哈维弧菌菌株，这对未来进行哈维弧菌基因工程改造，研究其致病机制和耐药机制等，具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的是提供敲除运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC在提高菌株接合转移效率中的应用。
[0006]优选，所述的菌株是哈维弧菌，所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp
‑
1661bp所示。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一株高接合转移效率哈维弧菌，其是将哈维弧菌的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC敲除，所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp
‑
1661bp。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种高接合转移效率哈维弧菌的构建方法，其是将哈维弧菌的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC敲除，获得高接合转移效率哈维弧菌，所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp
‑
1661bp。
[0009]优选，包括以下步骤：
[0010]步骤一、对哈维弧菌基因组上的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC设计基因敲除引物；
[0011]步骤二、以哈维弧菌为出发菌株，敲除所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC，相应获得基因缺失菌株V.harveyi 345
‑
ΔfimC，即为高接合转移效率的哈维弧菌。
[0012]优选地，步骤一中所述基因敲除引物为：上游同源臂扩增引物：aagcttgatatcgaattcCAAC CACTCGGAGTAAGCG和TTAGTATTCGATAGGTTCAACCTTGTATGCGTT，下游同源臂扩增引物TTGAACCTATCGAATACTAATTGGCATTTAACGGAT和ttggtaacgaatcagacCGATATCT CGACCTGTTGGATTAAG所示。
[0013]优选地，步骤二中，所述的敲除所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC具体包括如下步骤：
[0014](1)PCR扩增所述fimC基因上下游同源臂和线性化自杀质粒；
[0015](2)通过等温组装上下游同源臂和线性化自杀质粒，得到重组质粒，将所述的重组质粒先后转化入中间宿主E.coli GEB802和供体菌E.coli GEB883中，并通过PCR鉴定获得阳性克隆；
[0016](3)供体菌E.coli GEB883培养至对数早期(OD600nm＝0.3～0.7)，受体菌哈维弧菌345培养至对数早期(OD600nm＝0.3～0.7)；
[0017](4)对数早期受体菌哈维弧菌345于40℃热击处理30min，并与对数早期供体菌E.coli GEB883进行接合转移实验；
[0018](5)单交换克隆子及双交换克隆子的筛选、鉴定，即得fimC基因缺失的菌株，即为高接合转移效率的哈维弧菌。
[0019]优选地，步骤(1)中，所述自杀质粒为pSW7848。
[0020]优选地，步骤(5)中，所述的单交换克隆子的筛选具体指通过含34μg/mL氯霉素和0.2％D
‑
葡萄糖的平板筛选。
[0021]优选地，步骤(5)中，所述的双交换克隆子的筛选具体指通过含0.2％ L
‑
阿拉伯糖的平板筛选。
[0022]优选地，步骤(5)中，所述鉴定具体指设计通过引物对：GACTGTACAAACAACAGA AGTGG和AACAAGATTAGACATGGTATAGATTGATAG进行PCR鉴定
[0023]本专利技术的第四个目的是提供上述高接合转移效率哈维弧菌作为基因工程菌在基因敲除方面的应用。
[0024]本专利技术所述的出发菌株哈维弧菌345已经公布于NCBI(CP025537，CP025538，CP025539，CP025540)。本专利技术所涉及的重组质粒中间宿主E.coli GEB802、供体菌E.coli GEB883、质粒pSW7848已公布于该文献中：Deng YQ,Su YL,Liu SL,et al.Identification of a nov el small RNA srvg23535 in Vibrio alginolyticus ZJ
‑
T and its characterization with phenotyp e microarray technology[J].Frontiers in microbiology,2018:2394。本专利技术人也持有上述微生物，并保证自申请日起20年内向公众提供。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
[0026]相比于基因工程出发菌，V.harveyi 345
‑
ΔfimC的接合转移效率显著提高，且获得的单交换克隆子阳性率高，筛选工作量少，开辟了哈维弧菌通过接合转移及同源重组进行基因敲除的平台，有利于进一步的基因组改造和基因功能研究。
附图说明
[0027]图1为运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC敲除株的PCR鉴定；
[0028]其中，泳道M1：DNA Marker DL5000；泳道1：pSW7848线性化片段；泳道M2：DN AMarker DL2000；泳道2/3：fimC上/下游片段；泳道M3：DNA Marker DL5000；泳道4：重组子pSW7848
‑
fimC检测片段；泳道M4：DNA Marker DL2000；泳道5：以野生株哈维弧菌345基因组DNA为模板，fimC基因敲除鉴定引物扩增结果；泳道6：以fimC候选突变株基因组DNA为模板，fimC基因敲除鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敲除细菌运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC在提高菌株接合转移效率中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的菌株是哈维弧菌，所述的细菌运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp
‑
1661bp所示。3.一种高接合转移效率哈维弧菌，其特征在于，是将哈维弧菌的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC敲除，所述的细菌运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp
‑
1661bp所示。4.一种高接合转移效率哈维弧菌的构建方法，其特征在于，是将哈维弧菌的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC敲除，获得高接合转移效率哈维弧菌，所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC是SEQ ID NO.1的957bp
‑
1661bp。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、对哈维弧菌基因组上的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC设计基因敲除引物；步骤二、以哈维弧菌为出发菌株，敲除所述的运动和分泌伴侣蛋白编码基因fimC，相应获得基因缺失菌株V.harveyi 345
‑
ΔfimC，即为高接合转移效率的哈维弧菌。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤一中所述基因敲除引物为：上游同源臂扩增引物：aagcttgatatcgaattcCAACCACTCGGAGTAAGCG和TTAGTATTCGATAGGTTCAACCTTGTATGCGTT，下游同源臂扩增引物TTGAACCTATCGAATACTAATTGGCATTTAACGGAT和t...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓益琴，冯娟，徐力文，高斯傲，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：