高产丁二酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用技术

本申请涉及一种高产丁二酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。所述重组大肠杆菌是通过将大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34得到，所述pJ23119和所述RBS34的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本申请采用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
高产丁二酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用


[0001]本申请属于生物工程
，特别涉及一种高产丁二酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]丁二酸又称作琥珀酸，是一种重要的C4平台化合物，它被认为是生物技术生产的最具潜力的大宗化学品之一。作为合成通用化学品的起始原料，丁二酸可以取代苯或其他石油化工产品作为一系列化学衍生物的起始原料，在食品、化学、医药以及其他领域有广泛的应用，丁二酸被美国能源部列为12种最有潜力大宗生物基化学品中的首位。
[0003]目前研究较多的产丁二酸的菌种有：产琥珀酸放线杆菌、产琥珀酸曼氏杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌和大肠杆菌。产琥珀酸放线杆菌通常是从自然界中筛选，进行定向改造，能够耐受高浓度的丁二酸盐。Guettler等人从牛瘤胃中分离获得产琥珀酸放线杆菌，该菌株在65％C02和35％N2的混合气体环境下，在5L发酵罐中厌氧发酵36h，产丁二酸量达到70g/L，然后通过诱变，利用突变株产琥珀酸放线杆菌FZ53生产丁二酸产量最高，以葡萄糖为碳源，发酵48h产量可以达到最高产量110g/L，关于产琥珀酸放线杆菌菌种的研究较少，需要进一步的对其生理特性、发酵性能和遗传背景进行研究。产琥珀酸厌氧螺菌是在犬的口腔中分离得到，该菌为严格厌氧菌，发酵代谢产物以丁二酸和乙酸为主，伴有副产物乙酸和乙醇等，可以利用的发酵底物比较广泛，例如葡萄糖、乳糖、甘油等。Samuelov等人的研究结果表明，在最适条件下，产琥珀酸厌氧螺菌丁二酸的产率可以达到1.2mol/1.0mol葡萄糖，最高产量为65.0g/L，但是该菌株发酵需要严格的厌氧环境，工业化应用中很难实现。产琥珀酸曼氏杆菌是一种天然的丁二酸生产菌株，革兰氏阴性菌，兼性厌氧，能够固定二氧化碳并以丁二酸作为主要发酵产物，但是该菌株是维生素和氨基酸的两类营养缺陷型菌株，需要外源添加维生素和多种氨基酸维持菌体的生长和代谢。Lee等人通过改造苹果酸脱氢酶和高密度发酵策略使菌株M.succiniciproducensPALK
‑
CgMD丁二酸产量提高到134.25g/L。
[0004]但目前大肠杆菌发酵的生产效率较低，发酵液中通常有乳酸、甲酸、乙酸、乙醇等副产物，发酵过程辅因子代谢不平衡、厌氧条件胁迫导致代谢失衡、产品得率及生产强度低、发酵后期死亡率较高等问题。因此，亟需一种高效生产丁二酸的重组大肠杆菌。

技术实现思路

[0005]基于此，本申请提供一种能够高效生产丁二酸的重组大肠杆菌。
[0006]本申请的具体方案如下：
[0007]本申请一方面提供一种高产丁二酸的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是通过将大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34得到，所述pJ23119和所述RBS34的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0008]本申请另一方面提供一种如上述的重组大肠杆菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
[0009]提供大肠杆菌；
[0010]将所述大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34，得到所述重组大肠杆菌。
[0011]在其中一个实施例中，通过CRISPR
‑
cas9基因编辑技术将所述大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34。
[0012]在其中一个实施例中，所述通过CRISPR
‑
cas9基因编辑技术将所述大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34包括以下步骤：
[0013]S1：制备含有pCas
‑
lac质粒的大肠杆菌感受态；
[0014]S2：根据所要替换的iscS启动子和RBS构建相应的pTargetF
‑
N20质粒及DonorDNA；
[0015]S3：将所述pTargetF
‑
N20质粒及DonorDNA转化至所述含有pCas
‑
lac质粒的大肠杆菌感受态中；
[0016]S4：筛选出基因改造成功的菌株，诱导pCas
‑
lac质粒上sgRNA的转录，消除pTargetF
‑
20N质粒；
[0017]S5：消除pCas
‑
lac质粒。
[0018]在其中一个实施例中，所述大肠杆菌为重组菌株E.coli FMME
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N
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5(ΔfocA
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pflB
‑
ΔldhA
‑
Δpta
‑
ackA)。
[0019]本申请还提供一种上述的重组大肠杆菌在制备丁二酸中的应用。
[0020]本申请还提供一种丁二酸的制备方法，包括以下步骤：采用上述的重组大肠杆菌在发酵培养基中进行有氧
‑
厌氧两阶段发酵，得到含有丁二酸的发酵液。
[0021]在其中一个实施例中，所述的有氧
‑
厌氧两阶段发酵是在菌体OD
600
＝60～70时，将有氧阶段转为厌氧阶段。
[0022]在其中一个实施例中，将有氧阶段转为厌氧阶段是通过通入CO2气体或者添加10g/L～20g/L碳酸氢盐的方式进行。
[0023]在其中一个实施例中，在厌氧阶段，控制葡萄糖浓度为0～5g/L。
[0024]基于上述技术方案，本申请具有以下有益效果：
[0025]本申请采用CRISPR
‑
cas9基因编辑技术过量表达大肠杆菌iscS基因，通过将大肠杆菌中iscS的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34，更高表达强度的iscS能够促进硫化氢的产生，有助于维持大肠杆菌在厌氧条件下的细胞生长和存活，同时有利于丁二酸的积累，最终得到的工程菌株E.coli FMME
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N
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5(ΔfocA
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pflB
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ΔldhA
‑
Δpta
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ackA)
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iscS，发酵72h丁二酸产量达到了150g/L，厌氧阶段丁二酸得率达到1.03g/g葡萄糖、生产强度为2.08g/L/h，副产物甲酸不积累，乳酸、乙酸低于5g/L，72h死亡率降低了25.5％；本申请构建菌株有利于丁二酸的工业化生产。
附图说明
[0026]图1为实施例2中pTargetF
‑
iscS重组质粒结构图；
[0027]图2为实施例1及对比例1～9中制备得到的丁二酸(SUC)的酸浓度含量变化；
[0028]图3为对比例1和实施例1中构建工程菌株E.coli FMME
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N
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5(ΔfocA
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pflB
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ΔldhA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产丁二酸的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过将大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34得到，所述pJ23119和所述RBS34的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。2.一种如权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：提供大肠杆菌；将所述大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34，得到所述重组大肠杆菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，通过CRISPR
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cas9基因编辑技术将所述大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述通过CRISPR
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cas9基因编辑技术将所述大肠杆菌中iscS基因的启动子和RBS分别替换为pJ23119和RBS34包括以下步骤：S1：制备含有pCas
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lac质粒的大肠杆菌感受态；S2：根据所要替换的iscS启动子和RBS构建相应的pTargetF
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N20质粒及DonorDNA；S3：将所述pTargetF
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N20质粒及DonorDNA转化至所述含有pCas
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lac质粒的大肠杆菌感受...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，潘静宇，王学明，刘喜荣，曾春玲，陈修来，刘佳，高聪，谢斯思，孟浩，李静，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：