表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。所述解淀粉芽孢杆菌工程菌的tagV基因、tagT基因和/或tagO基因被敲除，且携带能够表达冰核蛋白基因的表达载体。本发明专利技术构建在缺失tagV、tagT和/或tagO基因活性的情况下表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，tagV、tagT和/或tagO基因属于LCP蛋白家族基因，可以影响磷壁酸的合成，缺失前述基因可以显著提升冰核蛋白活性和表达量，得到的工程菌的冰核活性高，且采用的解淀粉芽孢杆菌生物安全性菌株，可以直接利用表达冰核蛋白的菌体发挥冰核作用。挥冰核作用。挥冰核作用。

【技术实现步骤摘要】
表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]在温度下降到0℃的情况下，体积非常微小的纯水仍然能维持液态，不会立刻结冰，这种现象被称为过冷现象。冰核细菌可以诱导催化形成冰晶，进而提高水的冻结温度，在较高温度(
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2℃至
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7℃)下即可使水结冰。冰核细菌具有冰核活性是因为菌体外膜表达特异的冰核蛋白，该蛋白可以充当模板的作用，结合水分子形成类冰水分子的立体结构，促使冰晶形成。冰核细菌作为冰核诱发过冷却水在较高的温度下结冰的作用能力已被应用到人工造雪制冰、海水淡化、促冻杀虫，以及食品冷藏保鲜和冷冻浓缩等领域。冰核细菌可以提高冷冻食品的冰核形成温度，减少冻结时间，例如在食品原料如鱼肉、蛋白质、油脂中添加冰核细菌可使过冷却温度提高到
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3至
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4℃就可以完全冻结，总的冷却时间降低30％以上，大大节省能源和时间成本，而且可解决由于过冷却现象而生成大的冰晶对冷冻食品的风味和营养成分造成的过多损失，改善冷冻食品质构，其在冷冻食品工业中具有巨大的应用潜能和开发空间。
[0003]然而，具有冰核活性的细菌主要分属于草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)和黄单孢菌(Xanthomonas)等种属菌株，其中绝大部分的冰核细菌都属于植物致病性细菌，使得它们在食品加工中的应用受到很大限制。迄今为止，仅有日本批准了将具有冰核活性的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas camperstris)INXC
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1在高静压处理后可以应用于食品加工行业。纯化的冰核蛋白虽然可以解决病原菌安全性的问题，但冰核蛋白是膜蛋白，难以制备和纯化。利用基因工程技术，基于生物安全的工程菌有望获得表达冰核蛋白具有高冰核蛋白活性的生物安全菌株。但目前冰核蛋白的膜表达研究都集中在大肠杆菌中，而大肠杆菌为致病菌株，限制了其在食品等领域中的应用。因此，开发安全、无毒性、无致病性的高冰核活性工程菌种在食品等领域具有十分广阔的市场前景，对于冰核蛋白大规模、安全应用意义重大。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中冰核细菌致病性和/或冰核活性差的问题，本专利技术提供了一种表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌及其构建方法和应用，以解决或至少缓解现有技术中的部分问题。
[0005]本专利技术具体通过以下技术方案实现：
[0006]本专利技术的第一方面提供了一种表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌的tagV基因、tagT基因和/或tagO基因被敲除，且携带能够表达冰核蛋白基因的表达载体。
[0007]进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌tagV基因被敲除。
[0008]进一步地，所述tagV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述tagT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述tagO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]进一步地，所述冰核蛋白基因选自来源于丁香假单胞菌、荧光假单胞菌、草生欧文氏菌、菠萝欧文氏菌、油菜单胞菌小麦致病变种和噬夏孢欧文氏菌中的inaZ、inaW、inaC、inaE、inaA、inaX、iceE、inaU、inaV和iceE基因中的任一种。
[0010]更进一步地，所述冰核蛋白基因选自草生欧文氏菌菠萝变种的inaE基因，所述inaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]进一步地，所述表达载体还包括位于所述冰核蛋白基因上游的启动子和位于所述冰核蛋白基因下游的终止子，所述启动子选自P43启动子，所述终止子选自Tamyl终止子。
[0012]更进一步地，所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Tamyl终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0013]进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌的出发菌为解淀粉芽孢杆菌BAX
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9。
[0014]本专利技术的第二方面提供了如上所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：通过同源重组技术敲除解淀粉芽孢杆菌的tagV基因、tagT基因和/或tagO基因，并向所述解淀粉芽孢杆菌中转入表达冰核蛋白基因的表达载体，构建得到表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌。
[0015]进一步地，所述同源重组技术包括以下步骤：
[0016]S1、以解淀粉芽孢杆菌基因组为模板，分别采用tagV基因、tagT基因和tagO基因的上下游同源臂引物扩增上游同源臂序列A和下游同源臂序列B；其中，所述tagV基因的上下游同源臂引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10
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13所示，所述tagT基因的上下游同源臂引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14
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17所示，所述tagO基因的上下游同源臂引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18
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21所示；
[0017]S2、通过重叠延伸PCR技术将所述上游同源臂序列A和所述下游同源臂序列B连接在一起，形成同源序列C；其中，所述tagV基因、所述tagT基因和所述tagO基因的所述同源序列C的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7
‑
9所示；
[0018]S3、将所述同源序列C插入到温敏型敲除质粒T2(2)
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ori中，构建敲除质粒；
[0019]S4、将所述敲除质粒转入所述解淀粉芽孢杆菌的感受态中，通过单交换和双交换筛选得到所述tagV基因、所述tagT基因和所述tagO基因分别敲除的解淀粉芽孢杆菌突变株。
[0020]本专利技术的第三方面提供了如上所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌在人工造雪、海水淡化、杀虫、冷冻浓缩或冷冻食品工业中的应用。
[0021]本专利技术的优点及积极效果为：
[0022]1、本专利技术通过敲除解淀粉芽孢杆菌的tagV、tagT和/或tagO，并导入能够表达冰核蛋白基因的表达载体，得到能够在缺失tagV、tagT和/或tagO基因活性的情况下表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，tagV、tagT和/或tagO基因属于LCP蛋白家族基因，可以影响磷壁酸的合成，并进一步影响膜蛋白
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冰核蛋白的表达活性和表达量，实验发现，缺失前述基因可以显著提升冰核蛋白活性和表达量，得到的工程菌的冰核活性高，可达到Ⅱ型冰核温度。
[0023]2、本专利技术采用的解淀粉芽孢杆菌生物安全性菌株，可以直接利用表达冰核蛋白的
菌体发挥冰核作用，适用于稳定地大规模工业化生产，实现冰核细菌在食品中的安全应用，应用方式更为便捷。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌的tagV基因、tagT基因和/或tagO基因被敲除，且携带能够表达冰核蛋白基因的表达载体。2.根据权利要求1所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌tagV基因被敲除。3.根据权利要求1所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述tagV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述tagT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述tagO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求1所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述冰核蛋白基因选自来源于丁香假单胞菌、荧光假单胞菌、草生欧文氏菌、菠萝欧文氏菌、油菜单胞菌小麦致病变种和噬夏孢欧文氏菌中的inaZ、inaW、inaC、inaE、inaA、inaX、iceE、inaU、inaV和iceE基因中的任一种。5.根据权利要求4所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述冰核蛋白基因选自草生欧文氏菌菠萝变种的inaE基因，所述inaE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求1所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述表达载体还包括位于所述冰核蛋白基因上游的启动子和位于所述冰核蛋白基因下游的终止子，所述启动子选自P43启动子，所述终止子选自Tamyl终止子；所述P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Tamyl终止子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。7.根据权利要求1所述的表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌工程菌的出发菌为解淀粉芽孢杆菌BAX
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9。8.一种表达冰核蛋白的解淀粉芽孢杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，用于构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈义杰，宋蓉，魏雪团，李斌，黄庆荣，张莉，郑威，左靖南，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：