宿主PRKCSH基因作为靶点在防治多种RNA病毒感染中的应用制造技术

本发明专利技术公开了宿主PRKCSH基因作为靶点在防治多种RNA病毒感染中的应用，通过实验证实，敲除猪的PRKCSH基因可以显著抑制日本乙型脑炎病毒对宿主细胞的粘附与入侵，还可显著抑制猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、塞内卡病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒在宿主细胞中的复制，此外，敲除人的PRKCSH基因可以显著抑制日本乙型脑炎病毒在宿主细胞中的复制。因此，特异靶向编辑PRKCSH基因或干扰其蛋白表达可抑制多种RNA病毒侵染宿主细胞。蛋白表达可抑制多种RNA病毒侵染宿主细胞。

【技术实现步骤摘要】
宿主PRKCSH基因作为靶点在防治多种RNA病毒感染中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及宿主PRKCSH基因作为靶点在防治多种RNA病毒中的应用。

技术介绍

[0002]病毒性传染疾病一直是严重危害全球健康的主要病种之一。随着科学技术与社会经济的发展，我国畜牧养殖业逐步向工厂化、集约化的现代养殖模式转变。然而，规模化的养猪场中存在多种高致病性病毒疾病，如非洲猪瘟(ASFV)、伪狂犬病(PRV)和猪圆环病毒病(PCV)等，严重威胁猪群健康，阻碍生猪养殖的发展。
[0003]根据遗传物质的不同，可以将病毒分为DAN病毒与RNA病毒。目前我国养猪场中广泛流传的，如日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(IVA)和塞内卡病毒(SVA)等，均属于RNA病毒。面对复杂多变的传染性病毒，疫苗接种为最有效的防控措施，然而实际操作中存在生产成本高、工作难度大、患病猪只无法有效救治等问题。挖掘参与病毒复制的关键宿主因子，探究病毒
‑
宿主互作网络，能够为解析病毒感染机制提供理论基础，为抗病育种和病毒靶向药物的研发提供新思路。
[0004]蛋白质是生命活动的行使单位，许多生物学过程均可影响蛋白质的合成。内质网是蛋白质合成、修饰的重要场所，蛋白质的正确修饰影响着蛋白质的生物学功能。病毒感染宿主细胞，完成自身复制以及逃逸宿主免疫都极大地依赖于宿主细胞。研究表明，内质网在RNA病毒的复制和成熟过程中发挥重要作用，病毒能够挟持细胞的翻译机制，利用内质网作为复制场所，在内质网腔合成大量病毒蛋白。PRKCSH即蛋白激酶C(PKC)底物80K
‑
H，为定位于内质网上的多功能蛋白，它编码葡糖苷酶Ⅱ的β亚基，在宿主蛋白N
‑
糖基化修饰过程中，与其催化作用的葡糖苷酶Ⅱ的α
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亚基相互作用催化去掉N
‑
端α
‑
1,3连接的葡萄糖。因此，PRKCSH基因的表达对宿主蛋白的N
‑
糖基化修饰至关重要。临床研究发现PRKCSH基因突变能够引起常染色体显性多囊肝(ADPLD)，进一步利用小鼠模型研究发现PRKCSH能够选择性的激活UPR的IRE1α分支，通过交互作用促进 IRE1α磷酸化与寡聚化。乙型肝炎病毒(HBV)为环状双股DNA病毒，是引起乙型肝炎的病原体。研究发现，PRKCSH能够与HBV的X蛋白发生相互作用，过表达PRKCSH能够显著抑制HBV DNA的复制和HBs抗原的表达，通过不依赖泛素的蛋白酶体途径加速HBV的X蛋白的降解，从而抑制HBV在宿主细胞中的复制。然而，目前关于PRKCSH基因是否参与调控JEV、PRRSV、CSFV、 PEDV、TGEV和SVA等RNA病毒在宿主细胞中复制的研究未见报道，本研究旨在阐明宿主PRKCSH基因作为靶点在防治多种RNA病毒感染中的应用。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种新的靶点 PRKCSH基因，可用于防治多种RNA病毒感染。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0007]PRKCSH基因作为靶点用于制备防治猪RNA病毒感染的药物：所述的药物为靶向编辑猪PRKCSH基因或干扰PRKCSH蛋白表达的物质，防治的RNA病毒包括日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、塞内卡病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。具体地，所述的药物包括靶向敲除猪 PRKCSH基因的sgRNA或其表达载体，用于RNA干扰的dsRNA，反义寡核苷酸、小分子抑制剂。进一步优选地，靶向敲除猪PRKCSH基因的sgRNA序列为 5
’‑
CATCTGGAGGAGATGTACAG
‑3’
。
[0008]PRKCSH基因作为靶点用于制备防治人感染日本乙型脑炎病毒药物，具体地，所述的药物包括靶向敲除人PRKCSH基因的sgRNA或其表达载体，用于 RNA干扰的dsRNA，反义寡核苷酸、小分子抑制剂。进一步优选地，靶向敲除人PRKCSH基因的sgRNA序列为5
’‑
AACACCATCGTTGACCCGGT
‑3’
。
[0009]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了宿主PRKCSH基因作为靶点在防治多种RNA病毒感染中的应用。本专利技术发现通过特异性的靶向编辑猪和人的 PRKCSH基因，干扰或者完全缺失PRKCSH蛋白的表达对JEV感染宿主细胞过程中的粘附、入侵和复制阶段具有显著抑制作用。在蛋白缺失细胞株中定向回补 PRKCSH蛋白的表达，能够恢复JEV在宿主细胞中的复制。进一步，在猪的不同体细胞中干扰或者完全缺失PRKCSH蛋白的表达，能够显著抑制CSFV、SVA、 TGEV、PEDV和PRRSV等5种RNA病毒的复制。因此，宿主PRKCSH基因能够作为潜在靶点，防治由RNA病毒感染引发的多种疾病，具有重要的生产应用价值。
附图说明
[0010]图1为实施例1中利用Western Blot技术鉴定PRCKSH基因敲除单克隆细胞中PRKCSH蛋白表达情况。(a)为在PK15细胞中敲除PRKCSH基因；(b) 为在A549细胞中敲除PRCKSH基因。β
‑
actin指肌动蛋白；GAPDH指甘油醛
‑3‑ꢀ
磷酸脱氢酶；kDa为千道尔顿；Clone#1
‑
Clone#8代表挑选的8株单克隆细胞株。
[0011]图2为实施例2中利用RT
‑
PCR检测敲除PRKCSH基因对JEV感染PK15 细胞粘附和入侵阶段的影响。Binding为粘附阶段；Entry为入侵阶段；MOI为感染复数；内参基因为GAPDH；**表示p<0.01，***表示p<0.001。
[0012]图3为实施例2中检测敲除PRKCSH基因对JEV感染PK15细胞不同复制阶段的影响。(a)病毒空斑实验检测JEV粒子数量；(b)Western Blot检测JEV 编码NS3蛋白的表达。β
‑
actin指肌动蛋白；kDa为千道尔顿；hpi为感染时间。
[0013]图4为实施例2中利用Western Blot技术检测敲除PRKCSH基因对JEV感染A549细胞不同复制阶段的影响。MOCK代表JEV未感染的细胞；β
‑
actin指肌动蛋白；kDa为千道尔顿；hpi为感染时间。
[0014]图5为实施例3中利用Western Blot技术检测PRKCSH蛋白回补水平及JEV 编码NS3蛋白的表达情况。Flag
‑
PRKCSH表示pTRIP
‑
3Flag
‑
PRKCSH慢病毒，
“‑”
为不加慢病毒，“+”为加慢病毒；β
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.PRKCSH基因作为靶点在制备防治猪RNA病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的RNA病毒包括日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、塞内卡病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。2.PRKCSH基因作为靶点在制备防治人感染日本乙型脑炎病毒药物中的应用。3.用于防治猪RNA病毒感染的药物，其特征在于，所述的药物为靶向编辑猪PRKCSH基因或干扰PRKCSH蛋白表达的物质，所述的RNA病毒包括日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、塞内卡病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢胜松，赵书红，刘海龙，张永辉，王子畅，覃柳婞，郭子实，杨钰青，李新云，阮进学，刘向东，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：