体外药物筛选模型的应用以及体外筛选抗血管生成药物的方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，公开了体外药物筛选模型的应用以及体外筛选抗血管生成药物的方法。本发明专利技术提供的体外药物筛选模型具有成本低，效果稳定可靠，且能够更为准确地模拟肿瘤在体内的微环境，从而为临床试验提供更具可信度和参考价值的筛选结果和数据等优点。同时，还避免了体内实验操作繁琐、审批程序复杂、成本高等问题。此外，本发明专利技术提供的体外筛选模型还能够适用于不同类型的抗血管生成实验，针对抗肿瘤血管生成药物进行体外筛选，相比于现有的体外筛选细胞模型而言适用范围更广。现有的体外筛选细胞模型而言适用范围更广。现有的体外筛选细胞模型而言适用范围更广。

【技术实现步骤摘要】
体外药物筛选模型的应用以及体外筛选抗血管生成药物的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及体外药物筛选模型的应用以及体外筛选抗血管生成药物的方法

技术介绍

[0002]研究表明，抗血管生成可以显著抑制肿瘤的生长速度和转移性，对肿瘤的治疗具有重要意义。因此，抗血管生成药物的开发已经成为抗肿瘤药物研发的重要组成部分。药物研发和筛选过程十分漫长，在进行临床试验之前需要对新药进行多轮筛选。目前，抗肿瘤血管生成药物的筛选主要涉及体内和体外两种模型。成熟的体内模型种类较多，包括鸡胚尿囊膜、兔角膜、仓鼠颊囊、基质蛋白凝胶模型、盘面新血管生成系统等。但是，体内实验由于在活体动物体内进行，影响因素较多，容易产生假阳性结果对研究造成误导，而且还涉及动物伦理、人道主义、成本等诸多方面因素，因此体内模型并不适合在药物前期筛选这种需要开展大规模实验的阶段使用。体外模型是目前药物初筛阶段主要使用的评价模型，主要采用细胞系进行，其一为细胞的二维(2D)培养，也即，将肿瘤细胞/内皮细胞在培养皿中进行培养，达到一定细胞密度后加入药物，观察药物对细胞的增殖、迁移和血管生成能力(例如相关的细胞分泌物水平等)的影响，从而评价药物的抗血管生成效果；其二为细胞的三维(3D)培养，也即，在三维环境中对内皮细胞进行培养或者将内皮细胞和肿瘤细胞进行共培养，利用添加的外源性血管生长因子或者利用肿瘤细胞分泌的血管生长因子促使内皮细胞出芽或成管，通过对比药物存在与否对血管生成的影响，评价药物的抗血管生成效果。
[0003]虽然体外模型相比于体内模型能够大幅降低药物筛选成本，避免动物伦理等程序审批的麻烦，但是，目前的体外模型对于药物评价，尤其是抗肿瘤血管生成药物评价的适用性并不理想。首先，2D细胞培养的评价模型只能反映细胞对于药物的反应，并不能反映生物体组织的变化情况(例如血管的生成情况等)，使得评价结果对于后续临床试验的指导意义十分有限，而且2D培养的细胞具有充足的氧气和营养物质，这与体内实体瘤中存在低氧环境和生物因子浓度梯度的情况不符，因此无法真实反映药物对于肿瘤的实际作用效果。其次，3D细胞培养虽然同时具有体外细胞培养的直观性和条件可控性和可获得体内实验的生物表型等优势，但是目前用于研究肿瘤血管生成的3D细胞模型仍存在一定缺陷。例如，在共培养的三维微环境中添加外源性血管生长因子改变了微环境中固有的血管生长因子浓度，影响了肿瘤细胞和内皮细胞本身的旁分泌和自分泌功能的正常发挥，导致模型模拟的环境与肿瘤在体内的实际情况不符，又例如，在不加入外源性血管诱导因子的情况下，肿瘤细胞和内皮细胞的共培养体系不够稳定，无法稳定诱导血管生成，使得稳定模型的建立存在困难，从而导致结果的可信度下降，另外，肿瘤细胞与内皮细胞共培养的3D模型仍不能充分模拟肿瘤在体内的真实状态，使得获得的结果对于临床试验的指导性仍待提高。因此，亟需开发建立方法简单，同时又能够提供更贴近肿瘤真实状态的数据，对于后续临床试验指导性较强的体外抗肿瘤血管生成药物筛选模型。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的体内模型成本高，影响结果的因素复杂多变，且存在伦理、人道主义、流程审批等多方面的不便，同时又缺乏能够稳定高效地为抗血管生成药物提供准确有效，且对临床试验指导性强的参考数据的体外筛选模型等问题，提供体外药物筛选模型的应用以及体外筛选抗血管生成药物的方法。该体外药物筛选模型具有血管生成能力稳定，能够更为准确地模拟肿瘤在体内的微环境，从而提供准确度和可信度更高的筛选结果的优点。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术一方面提供体外药物筛选模型在抗肿瘤药物筛选中的应用，特别是在抗肿瘤血管生成药物筛选中的应用；该体外药物筛选模型包括肿瘤细胞和/或其培养上清，免疫细胞和/或其培养上清，以及内皮细胞；其中，所述内皮细胞能够在该体外药物筛选模型的共培养体系中形成血管。
[0006]本专利技术第二方面提供一种体外筛选抗血管生成药物的方法，所述方法包括在待筛选药物存在下，将肿瘤细胞和/或其培养上清，免疫细胞和/或其培养上清，以及内皮细胞进行共培养，并观察该共培养体系中的血管生成情况。
[0007]通过上述技术方案，本专利技术能够取得如下有益效果：
[0008](1)本专利技术提供的体外药物筛选模型以共培养的细胞为主体，相比于动物模型等体内模型而言，使用更加方便，还能避免动物实验相关的伦理问题论证和审批程序，更适合药物的大批量前期筛选时使用。而且该体外模型相比于体内模型而言影响因素较为单一，更能从细胞层面直接反应药物对血管生成的抑制作用，采用该模型进行药物评价时分析过程较为简单，结果较为直接，十分适合药物研发过程中的初筛阶段使用；
[0009](2)本专利技术提供的体外药物筛选模型在细胞用量较少时(使用96孔板时，低至104个细胞/孔水平)即能够稳定形成血管，相比于现有技术中单独采用内皮细胞或采用内皮细胞和肿瘤细胞共培养的成管试验筛选模型，本专利技术提供的筛选模型的细胞用量更少，血管形成效果更好更稳定，用于抗血管生成药物的筛选时结果可信度更高；
[0010](3)本专利技术提供的体外药物筛选模型既可以在2D成管试验中进行抗血管药物筛选，也可以在3D成球试验中进行抗血管药物筛选，适用范围较广，而且相比于传统的二维培养筛选方式，采用本专利技术提供的筛选模型进行药物筛选时，更贴近肿瘤在体内的组织微环境，提供的筛选结果更能为之后的临床试验提供正确的、参考价值较高的指导作用。
附图说明
[0011]图1是实施例1中实验组I的二维成管试验结果图。
[0012]图2是实施例1中对照组I的二维成管试验结果图。
[0013]图3是实施例1中对照组II的二维成管试验结果图。
[0014]图4是实施例1中对照组III的二维成管试验结果图。
[0015]图5是实施例1中对照组IV、V、VI的二维成管试验结果图。
[0016]图6是实施例1中实验组I
‑
3的药物筛选模拟试验结果图(光镜)。
[0017]图7是实施例1中实验组I
‑
3的药物筛选模拟试验结果图(荧光)。
[0018]图8是实施例1中对照组II
‑
2的药物筛选模拟试验结果图(光镜)。
[0019]图9实施例1中对照组II
‑
2的药物筛选模拟试验结果图(荧光)。
[0020]图10是实施例1中采用不同浓度仑伐替尼对实验组I
‑
3和对照组II
‑
2进行处理时，培养上清中的VEGF含量变化曲线图。
[0021]图11是实施例1中采用不同浓度阿帕替尼对实验组I
‑
3和对照组II
‑
2进行处理时，培养上清中的VEGF含量变化曲线图。
[0022]图12是实施例2中实验组的三维成球试验结果图。
[0023]图13是实施例2中对照组I的三维成球试验结果图。
[0024]图14是实施例2中对照组II的三维成球试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.体外药物筛选模型在抗肿瘤药物筛选中的应用，特别是在抗肿瘤血管生成药物筛选中的应用；该体外药物筛选模型包括肿瘤细胞和/或其培养上清，免疫细胞和/或其培养上清，以及内皮细胞；其中，所述内皮细胞能够在该体外药物筛选模型的共培养体系中形成血管。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述内皮细胞选自血管内皮细胞；和/或，所述肿瘤细胞选自具有恶性增殖能力的实质细胞，优选选自肝癌细胞和/或肺癌细胞；和/或，所述免疫细胞选自具有诱导肿瘤血管生成功能的免疫细胞，优选选自单核
‑
巨噬细胞。3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述内皮细胞选自HUVEC和/或MEC；和/或，所述肿瘤细胞选自HepG2、Huh7和A549中的至少一种；和/或，所述免疫细胞选自THP
‑
1和/或RAW264.7。4.根据权利要求1所述的应用，其中，以活细胞数计，所述内皮细胞、肿瘤细胞和免疫细胞在共培养体系中的初始用量比为2
‑
10:1:2
‑
10，优选为5
‑
10:1:5
‑
10；优选地，以活细胞数计，所述内皮细胞和免疫细胞在共培养体系中的初始用量比为1:0.3
‑
2。5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述共培养体系为三维细胞培养体系，优选所述共培养选用培养孔中包被了Matrigel基质胶的细胞培养板或选用三维细胞球培养装置进行；优选地，所述三维细胞球培养装置选自球状微孔细胞培养板。6.一种体外筛选抗肿瘤血管生成药物的方法，其特征在于，所述方法包括在待筛选药物的存在下，将肿瘤细胞和/或其培养上清，免疫细胞和/或其培养上清，以及内皮细胞进行共培养，并观察该共培养体系中的血管生成情况。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述内皮细胞选自血管内皮细胞；和/或，所述肿瘤...

【专利技术属性】
技术研发人员：安云鹤，水素芳，程小艳，田彦捷，魏玲，李宝明，管笛，
申请(专利权)人：北京市科学技术研究院分析测试研究所北京市理化分析测试中心，
类型：发明
国别省市：