耐碱蛋白A变体去除样品中IgG抗体的应用制造技术

本发明专利技术公开了蛋白A变体，尤其是具有高耐碱性以及高IgG结合亲和力的蛋白A变体。本发明专利技术还公开了该蛋白A变体的应用。还公开了该蛋白A变体的应用。还公开了该蛋白A变体的应用。

【技术实现步骤摘要】
耐碱蛋白A变体去除样品中IgG抗体的应用
[0001]本申请为2021年12月21日提交的、申请号为202111572524.4的中国专利申请的分案申请，在此通过引用将其全文并入本文。


[0002]本专利技术涉及蛋白A变体，尤其是具有高耐碱性的蛋白A变体。本专利技术还涉及该蛋白A变体的应用。

技术介绍

[0003]近年来，抗体药物发展迅速。2020年，全球销售额前10位的药物中有一半是抗体药物。抗体药物生产工艺中的纯化步骤通常采用经典的三步或两步层析法。金黄色葡萄球菌蛋白A是上世纪70年代发现的能与多物种抗体Fc端进行结合的菌体蛋白，自发现以来就一直作为重要的抗体纯化层析配体进行研究，目前也是商业化较完善、应用较为广泛的亲和配基。研究发现，蛋白A配基上多个区域对抗体Fc段独特的专一吸附能力，可用作抗体的特异性捕获，一步工艺即可去除细胞发酵液中大部分的杂质，可达98％以上的纯度。随着抗体药物的发展，用作抗体捕获的亲和层析介质也取得了快速发展。
[0004]亲和层析介质的选择与产品的质量息息相关。例如早期蛋白A(Protein A)亲和层析配基脱落严重，不易清洗，若这些工艺相关杂质不能在后续工艺中很好地去除，则存在引起免疫反应的风险，进而对药品质量提出很大挑战。因此，外国填料生产商很早就开始致力于增加介质的配基稳定性、结合载量和碱耐受性。例如目前主流蛋白A亲和层析介质如Cytiva公司的MabSelect SuRe，为耐碱层析介质，可耐0.1
‑
0.5M NaOH清洗，从而高效、低成本地除去附着在填料上的蛋白沉淀物、疏水性蛋白、核酸、内毒素和病毒等。配基稳定性也得到了增强，配基脱落<100ppm。动态结合载量达到30g/L以上。目前国内抗体药物生产企业大都采用进口蛋白A亲和层析介质。而这些进口蛋白A亲和层析介质通常价格昂贵，约占抗体药物下游纯化工艺中层析介质总成本的85％，并且存在各种可改进的不足之处。例如，MabSelect SuRe的基架微球为高交联的琼脂糖，优点是亲水性极佳，生物相容性好，非常适合抗体类生物大分子的分离纯化；但缺点是：其一，结构偏软，粒径分布较宽，在实际使用过程中存在装柱重复性差，机械强度低等问题；其二，Mabselect Sure在生物制药中一般使用0.1M NaOH清洗，其耐碱性能还有差距；其三，MabSelect Sure的动态载量>30g/L，对于大规模高表达量抗体生产所需的载量还有一定差距。又如，Millipore公司的Prosep Ultra Plus也是一种使用较为广泛的蛋白A亲和层析介质，基质为孔道可控的玻璃珠结构，物理稳定好，载量很高。但是，玻璃珠结构有一致命缺陷，即不可耐受高浓度NaOH清洗，因而限制其在大规模生物样品中应用。
[0005]正因为进口填料昂贵的价格以及各种不足，因此有必要开发国产高效低成本的蛋白A亲和填料。

技术实现思路

[0006]本文提供了耐碱蛋白A变体在去除样品中IgG抗体中的应用，其中所述耐碱蛋白A变体包括
[0007]1)SEQ ID NO：1
‑
3、5
‑
10中任一个所示的氨基酸序列；或
[0008]2)与SEQ ID NO：1
‑
3、5
‑
10中任一个所示的氨基酸序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
[0009]在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体与IgG抗体结合的KD值不高于1
×
10
‑6M、不高于1
×
10
‑7M或不高于3
×
10
‑8M。
[0010]在一些实施方案中，所述IgG抗体为IgG1分子。
[0011]在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0012]在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0013]在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0014]在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体为融合蛋白形式，所述融合蛋白包括串联连接的2个、3个、4个、5个或更多个所述耐碱蛋白A变体。
[0015]在一些实施方案中，所述样品为血液。
[0016]在一些实施方案中，所述述耐碱蛋白A变体被偶联至琼脂糖微球。
附图说明
[0017]图1为蛋白A结构示意图。其中S为信号序列、E、D、B、A、C为五个IgG结合结构域，X和M序列与细胞壁附着有关。图中还显示了Z结构域，其为B结构域的突变版本，相对于B结构域包括G29A突变。
[0018]图2为本专利技术蛋白A变体定向优化方法的流程图。
[0019]图3为本专利技术获得的蛋白A变体目标序列与初始序列间的同一性矩阵图。
[0020]图4为用于蛋白A变体的表达的pET28a(+)载体图谱。
[0021]图5为纯化后蛋白A变体的电泳图。
[0022]图6显示了本专利技术蛋白A变体动态载量的测定结果。
具体实施方式
[0023]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0024]蛋白A(protein A，SpA)为一种来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁蛋白。天然蛋白A含有五个高度同源的结构域，分别为E、D、A、B和C结构域(图1)。每个结构域都能够与人或其他哺乳动物如小鼠、猪、狗、牛等的免疫球蛋白G(IgG)的Fc段结合，这种结合通常不影响IgG分子中的Fab片段与抗原特异性结合的能力。天然蛋白A在与微球(如琼脂糖)偶联后或以其他方式固定后被广泛用于抗体分子的纯化。由于天然蛋白A的五个结构域与相同抗体分子的结合强度会稍有差异，导致洗脱条件不一，经常需要在不同pH或变性剂浓度条件下对纯化产物进行洗脱，导致操作复杂或抗体分子因经受不了这样的条件而失活。因此，有研究者例如采用基因工程技术对蛋白A基因进行改造，仅使用某一种或几种特定的结构域进行串联，使获得的重组蛋白A具有期望的结合亲和力或其他特性(例如
耐碱性)。
[0025]“结构域(domain)”指较大的蛋白分子中在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构。对于较小的蛋白分子来说，结构域常常等同于其三级结构。结构域可以具有特定的功能，例如与配体结合(例如蛋白A的B结构域与IgG结合)，或者酶学活性等。在本文中，除非另有说明，结构域也可指多肽片段或仅包括一个结构域的蛋白本身。
[0026]“蛋白A变体”通常指具有IgG结合能力而在氨基酸序列上不同于天然蛋白A或其特定结构域的蛋白或蛋白结构域，例如可相对天然蛋白A包括一个或更多个氨基酸突变(例如替换、缺失、插入等)。在本文中，“蛋白A变体”指专利技术人在蛋白A和其他蛋白基础上进行定向优化后获得的目标蛋白(或多肽片段)，其在氨基酸序列上明显不同于天然本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.耐碱蛋白A变体在去除样品中IgG抗体中的应用，其中所述耐碱蛋白A变体包括1)SEQ ID NO：1
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3、5
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10中任一个所示的氨基酸序列；或2)与SEQ ID NO：1
‑
3、5
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10中任一个所示的氨基酸序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的应用，其中所述耐碱蛋白A变体与所述IgG抗体结合的KD值不高于1
×
10
‑6M、不高于1
×
10
‑7M或不高于3
×
10
‑8M。3.如权利要求2所述的应用，其中所述IgG抗体为IgG1分子。4.如权利要求1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：王智，
申请(专利权)人：科迈思北京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：