OsOPR13基因在调控水稻种子萌发中的应用制造技术

本发明专利技术公开了OsOPR13基因在调控水稻种子萌发中的应用。本发明专利技术的OsOPR13基因可用于调控水稻种子萌发，OsOPR13基因敲除株系表现为种子在淹水条件下萌发快速且整齐表型。本发明专利技术对于解决水稻直播过程中的种子发芽困难、出苗整齐度低等问题意义重大，在植物育种中具有广阔的应用前景。阔的应用前景。阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
OsOPR13基因在调控水稻种子萌发中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及OsOPR13基因在调控水稻种子萌发中的应用。

技术介绍

[0002]水稻是我国主要的粮食作物之一，世界上超过一半的人口以稻米为食，其产量的高低直接影响着基本民生问题。水稻种子萌发能力和速度的差异会影响出苗一致性和整齐度，进而影响产量形成。同时随着经济和城镇化的快速发展，减少劳动力、降低成本、便于机械化简便操作的水稻直播技术越来越受到重视。而针对直播技术推广需要攻克的关键就是种子的萌发问题。
[0003]OsOPR13属于古老黄酶(old yellow enzyme, OYE)家族，是一种黄素单核苷酸(Flavinmononucleotide, FMN)依赖的氧化还原酶，能够还原毗邻α,β
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不饱和醛或酮的双键，催化OPDA生成OPC
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8:0。根据OPRs在催化底物OPDA还原时表现的底物选择性，将水稻中的13个OPRs分为5个亚组，OsOPR7属于第二亚组，与拟南芥AtOPR3都参与JA的生物合成；OsOPR3属于第三亚组，能够调控水稻植株对咀嚼式昆虫的抗性，但并不参与水稻稻瘟病的调控；OsOPR13属于第五亚组，至今未见文献报道，其功能仍不清楚。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服现有技术的上述缺陷和不足，提供OsOPR13基因在调控水稻种子萌发中的应用。
[0005]本专利技术经实验证实，OsOPR13基因与水稻种子萌发相关，通过CRISPR/Cas9编辑OsOPR13基因后，在水淹状态下，与野生型相比，OsOPR13基因突变水稻种子萌发更快速且整齐。OsOPR13基因及其编码的蛋白可用于调控种子萌发的表型，因此可以将水稻OsOPR13基因或蛋白应用于植物育种中。
[0006]因此，本专利技术的第一个目的是提供OsOPR13基因在调控种子萌发中的应用，所述的OsOPR13基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。
[0007]优选，所述的OsOPR13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选，所述的应用，为降低表达（敲除）OsOPR13基因在种子水淹条件下加快种子萌发和提高出苗整齐度中的应用。
[0009]优选，所述的种子为禾本科植物种子。
[0010]优选，所述的种子为水稻种子。
[0011]本专利技术的第二个目的是提供一种获得加快种子萌发和提高出苗整齐度的改良水稻的方法，其包含在水稻中敲除OsOPR13基因的步骤。
[0012]优选，所述的方法，包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建OsOPR13基因的敲除载体，其中，所述的OsOPR13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，用于构建敲除载体的两个特异性靶点序列为靶点1：ACACATAGGATGCCTGTGTAAGG和靶点2：CGAAGCGGCAGCGGTTCTGCAGG；然后将敲除载体通过农杆菌侵染水稻愈伤组织的方式转入水
稻细胞并整合到染色体上，筛选成功敲除OsOPR13基因的细胞、组织或器官再生成植株。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的OsOPR13基因及其编码蛋白可用于调控水淹条件下水稻种子萌发。OsOPR13基因敲除株系表现为种子在淹水条件下萌发加快且整齐表型。因此，可为解决水稻种子直播过程中的萌发迟缓、种子发芽不整齐等问题以及培育新的水稻品种提供基因资源。本专利技术对于解决水稻直播过程中的种子发芽困难、出苗整齐度低等问题意义重大，在植物育种中具有广阔的应用前景。
附图说明
[0014]图1是生物统计分析WT、osopr13
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26、osopr13
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30和osopr13
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34在水淹条件下的萌发率。
[0015]图2是生物统计分析WT、osopr13
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26、osopr13
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30和osopr13
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34在水淹条件下萌发144 h后的茎长。
[0016]图3是生物统计分析WT、osopr13
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26、osopr13
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30和osopr13
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34在水淹条件下萌发144 h后的根长。
[0017]图4是WT、osopr13
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26、osopr13
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30和osopr13
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34水稻种子在水淹条件下萌发72 h后的实物图。
具体实施方式
[0018]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0019]实施例1：OsOPR13基因敲除载体的构建及水稻基因敲除植株的获得1、OsOPR13纯合突变体植株的构建利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对野生型水稻(中花11)中OsOPR13基因进行编辑来获得基因敲除突变体植株。具体如下：利用CRISPR
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P v2.0网站(http://crispr .hzau .edu .cn/cgi
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bin/CRI SPR2/CRISPR)对目标基因OsOPR13 (其CDS序列如SEQ ID NO.1所示，全长1131 bp，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，376个氨基酸)的外显子序列进行分析，挑选出两个特异性靶点序列，分别为靶点1：ACACATAGGATGCCTGTGTAAGG和靶点2：CGAAGCGGCAGCGGTTCTGCAGG。通过重叠PCR分别获得了两个与sgRNA相连接的表达盒U6a
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靶点1
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sgRNA和U3
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靶点2
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sgRNA。利用BsaI酶的切割位点和识别位点不重叠的特性把这两个表达盒连入pYLCRISPR/Cas9Pubi
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H载体上，产生含有OsOPR13特异性靶点的pCRISPR
‑ꢀ
OsOPR13载体，并转化至农杆菌EHA105感受态细胞中。将阳性克隆提取质粒后，送至公司进行测序，选择结果正确的pCRISPR
‑ꢀ
OsOPR13质粒通过农杆菌侵染水稻愈伤组织的方法，筛选成功敲除OsOPR13基因的组织，再生获得基因敲除突变体植株。
[0020]2、OsOPR13纯合突变体植株的鉴定提取单株T0代转基因植株的基因组总DNA，并以此为模板，使用位于OsOPR13靶点两端侧翼的引物 (F: TGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGC；R: GTTCGACAGCGTCTCCGACCTGAT)对含有靶点1和2的序列进行PCR扩增，将目的条带单一且清晰的扩增产物进行回收，并送至公司进行测序。测序之后，利用DSDecodeM网站(http://skl .scau .edu .cn/dsde code/)对测
序结果进行解码分析，选取了独立本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. OsOPR13基因在调控水稻种子萌发中的应用，其特征在于，所述的OsOPR13基因为编码SEQ ID NO.2所示蛋白的基因。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的OsOPR13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为OsOPR13基因在加快水稻种子萌发和提高水稻种子出苗整齐度中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的水稻种子为水淹条件下的水稻种子。5.一种获得加快种子萌发和提高种子萌发率的改良水稻的方法，其特征在于，包含在水稻中敲除Os...

【专利技术属性】
技术研发人员：史敬芳，张艺馨，刘军，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：