褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂制造技术

本发明专利技术公开了涉及害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及一种褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂；其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。纳米化杀虫剂的原料包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2

【技术实现步骤摘要】
褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂


[0001]本专利技术涉及害虫抗药性机理与防治领域，具体涉及一种褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂。

技术介绍

[0002]杀虫剂在农业害虫防治中发挥了重要作用，但连续、大量、单一使用一种或一类药剂加速了害虫抗药性进化速度。害虫抗药性已成为世界范围内普遍存在的问题并日趋严重，至今已有700余种昆虫及螨类对不同种类农药产生了不同程度的抗药性。褐飞虱Nilaparvata lugens(Brown planthopper)是一种世界性的水稻害虫，具有繁殖快、爆发性强等特点，由于化学农药长期、不合理使用以及褐飞虱自身的生物学特性，褐飞虱已对多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。代谢抗性是昆虫对杀虫剂产生抗药性的重要原因，主要表现为一系列解毒酶活性的提高。
[0003]在目前的害虫抗药性治理当中，由于农业生产者的不专业，导致害虫抗药性增加、农药用量增加、害虫抗药性进一步增加的恶性循环在害虫抗药性治理中屡见不鲜。目前害虫抗药性治理面临着巨大的困境，害虫抗药性发展速度已经超过了新药剂开发速度，并且新药的开发困难重重，新的靶标难以引入，所以如何利用好现有杀虫剂，并且高效精准克服害虫抗药性成为重要的科学问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1及其治理农业害虫抗药性的杀虫剂，本专利技术以ZIF
‑
8为载体，同时负载杀虫剂与dsRNA，高效靶向递送dsRNA沉默靶标基因并提高了杀虫剂的递送效率，达到克服害虫抗药性的目的，进而实现对害虫的抗药性治理。
[0005]为实现上述目的，本专利技术所设计了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]本专利技术还提供了一种用于获得上述褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1的引物对，所述引物对为：
[0008]上游引物：5
’‑
GCTCTAGAGTCAACTTCTACGTTTACTCCTATTG
‑3’
，下游引物：5
’‑
CCCTCGAGATCACATTCAGCCCGTAGTTGTTTG
‑3’
。
[0009]本专利技术还提供了一种重组载体pESI
‑
T
‑
NlCYP6ER1，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1的表达载体，其中，所述表达载体为pESI
‑
T载体。
[0010]本专利技术还提供了一种重组载体L4440
‑
NlCYP6ER1，所述重组载体含有上述褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1的表达载体，其中，所述表达载体为L4440。
[0011]本专利技术还提供了一种含有上述重组载体L4440
‑
NlCYP6ER1的宿主细胞，所述宿主细胞为HT115感受态细胞。
[0012]本专利技术还提供了一种利用上述宿主细胞诱导提取dsNlCYP6ER1的方法，所述方法是将含有重组载体L4440
‑
NLCYP6ER1的宿主细胞培养，摇至OD600＝0.40左右加入IPTG，使其终浓度为1mM，进行诱导表达，37℃振荡培养4h，提取细菌总RNA，纯化后得到的dsRNA，即为dsNlCYP6ER1。
[0013]本专利技术还提供了一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂，其特征在于：所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13～14份的2
‑
甲基咪唑、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsNlCYP6ER1。
[0014]进一步地，所述纳米化杀虫剂的原料按重量份数比计包括1份的六水合硝酸锌、13.86份的2
‑
甲基咪唑、1份的吡虫啉和0.080份的dsNlCYP6ER1。
[0015]本专利技术还提供了一种治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂的制备方法，包括以下步骤：
[0016]1)按重量份数比称取1份的六水合硝酸锌溶液、13～14份的2
‑
甲基咪唑溶液、0.5～1.5份的吡虫啉和0.050～0.10份的权利要求6所述方法制备得到的dsNlCYP6ER1；
[0017]2)将六水合硝酸锌和2
‑
甲基咪唑分别溶于水中，分别得到六水合硝酸锌溶液(Zn(NO3)2·
6H2O溶液)和2
‑
甲基咪唑溶液；
[0018]3)将吡虫啉溶液溶于二甲基亚砜DMSO中，得到吡虫啉饱和DMSO溶液；
[0019]4)将dsNlCYP6ER1加入六水合硝酸锌溶液，室温搅拌；得到反应溶液；然后向反应溶液中加入吡虫啉饱和DMSO溶液，室温搅拌混合均匀，最后加入2
‑
甲基咪唑溶液室温反应，反应结束后，10000rpm下离心收集吡虫啉/dsNlCYP6ER1@ZIF
‑
8纳米颗粒，用去离子水和无水乙醇洗涤三次，真空干燥；最终得到纳米化杀虫剂。
[0020]本专利技术还提供了一种上述的治理农业害虫抗药性的纳米化杀虫剂在防治褐飞虱中的应用。
[0021]本专利技术原理：
[0022]RNA干扰(RNAi)是生物学中普遍存在的现象。它是一种小干扰RNA(siRNA)介导的转录后基因沉默，具有特异性、高效性和可传递性等特点。在过去的几年里，借助RNA干扰(RNAi)下调多细胞生物的靶基因已成为成熟的技术，但是RNAi存在一定缺陷，将dsRNA注入体腔可以成功触发RNAi，而饲喂相同dsRNA的效率较低，或完全无效。所以增加RNAi效率是目前RNAi技术应用于克服害虫抗药性的首要任务。
[0023]纳米材料作为一种新兴材料在多个领域得到运用，我们发现以纳米材料作为载体，保护并递送dsRNA或siRNA可以大幅提升RNAi效率，并且粒径200nm以下的纳米材料可以在植物体内吸收传导。纳米材料的这些特性对于RNAi技术在实际的应用提供了更多的可能。沸石咪唑酯骨架材料(Zeolitic Imidazolate Framework
‑
8,ZIF
‑
8)是由Zn(Ⅱ)与2
‑
甲基咪唑配位自组装形成的多孔结晶材料，具备化学稳定性高，晶型和孔径可控，比表面积和孔体积大，生物相容性良好等优点，是极具潜力的纳米农药载体。
[0024]基于以上原因本专利技术选择褐飞虱作为模式昆虫，选择NlCYP6ER1作为靶标基因，提供一种纳米材料共同递送dsRNA与杀虫剂在害虫抗药性治理中的方法。
[0025]本专利技术的有益效果：
[0026](1)利用HT115...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种用于获得权利要求1所述褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1的引物对，其特征在于：所述引物对为：上游引物：5
’‑
GCTCTAGAGTCAACTTCTACGTTTACTCCTATTG
‑3’
，下游引物：5
’‑
CCCTCGAGATCACATTCAGCCCGTAGTTGTTTG
‑3’
。3.一种重组载体pESI
‑
T
‑
NlCYP6ER1，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1的表达载体，其中，所述表达载体为pESI
‑
T载体。4.一种重组载体L4440
‑
NlCYP6ER1，其特征在于：所述重组载体含有权利要求1所述褐飞虱细胞色素P450基因NlCYP6ER1的表达载体，其中，所述表达载体为L4440。5.一种含有权利要求4所述重组载体L4440
‑
NlCYP6ER1的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为HT115感受态细胞。6.利用权利要求5所述宿主细胞诱导提取dsNlCYP6ER1的方法，其特征在于：所述方法是将含有重组载体L4440
‑
NlCYP6ER1的宿主细胞培养，摇至OD600＝0.40左右加入IPTG，使其终浓度为0.4mM，进行诱导表达，37℃振荡培养4h，提取细菌总RNA，纯化后得到的dsRNA，即为dsNlCYP6ER1。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：何顺，万虎，马康生，于畅，李建洪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：