一种亚油酸合酶基因、克隆方法及其应用技术

本发明专利技术属于分子生物学和代谢工程技术领域，公开了一种亚油酸合酶基因、克隆方法及其应用，亚油酸合酶基因FAD2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，基因FAD2编码蛋白质的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.2。生物合成亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法包括：以酿酒酵母为出发菌株，敲除FAA4和FAA1基因，过表达TGL1、TGL3、TGL5和FAD2基因；TGL1基因整合到FAA4基因位点；TGL3和TGL5基因整合到FAA1基因位点；FAD2基因与组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，整合到NDT80位点。本发明专利技术基于过表达亚油酸合酶基因FAD2提高酵母亚油酸产量的代谢工程方法效果显著。法效果显著。法效果显著。

【技术实现步骤摘要】
一种亚油酸合酶基因、克隆方法及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和代谢工程
，尤其涉及一种亚油酸合酶基因、克隆方法及其应用。

技术介绍

[0002]目前，亚油酸(linoleic acid)是一种具有极高药用价值和经济价值的ω
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6型不饱和脂肪酸，是最早发现的人体必需多不饱和脂肪酸。现代研究表明，亚油酸具有广泛的药理作用，表现出良好的抗炎、抗过敏和抗氧化作用，能够降低胆固醇，维持血脂代谢平衡，以及预防糖尿病、心血管疾病等。
[0003]目前，制备亚油酸的常用方法有尿素包合法、硝酸银硅胶柱色谱法、分子蒸馏法和脂肪酶解法等。其中以尿素包合法最为常用，但由于其难以将双键相近的脂肪酸分开，导致亚油酸纯度较低，且包合过程中易生成致癌副产物，难以在食品和制药行业中大规模应用。因此，亚油酸的制备还有很大的探索前景。合成生物学的发展为亚油酸的工业化生产提供了一个新的可行方法。在生物合成底盘菌株中，酿酒酵母是一个广泛应用于合成生物学和代谢工程的模式微生物，其遗传操作相对简单，基因组测序已全部完成并公开。通过在酿酒酵母中导入特定编码酶的基因以增加特定脂肪酸的含量，并将亚油酸合酶基因导入酿酒酵母中，可以增加亚油酸的产量。
[0004]亚油酸合酶，即油酸去饱和酶(Oilacid desaturase，FAD2)，是亚油酸合成的关键酶，也是生成多不饱和脂肪酸的第一步关键调控酶，以往的报道中，通过在酿酒酵母中异源表达来自克鲁维酵母的KlFAD2，可催化油酸产生亚油酸，但亚油酸的产量较低。迄今为止，还没有发现一种亚油酸合酶可以在酵母中实现大规模特异性生产亚油酸。为了满足亚油酸规模化生产的要求，找到一种催化能力和特异性更强的亚油酸合酶，并构建生物合成亚油酸的微生物细胞工厂，是工业化制备这一高价值不饱和脂肪酸的关键。
[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前制备亚油酸的方法中，尿素包合法难以将双键相近的脂肪酸分开，导致亚油酸的纯度和产量较低，且包合过程中易生成致癌副产物，难以在食品和制药行业中大规模应用。同时，现有亚油酸的生物合成制备方法产量低，难以满足市场需求。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种亚油酸合酶基因、克隆方法及其应用。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种新的亚油酸合酶基因，亚油酸合酶基因为FAD2，亚油酸合酶基因FAD2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
[0008]进一步，从红酵母菌株中克隆得到一个新的亚油酸合酶基因，将其转入酿酒酵母菌株中，经脂肪酸生物合成相关代谢途径的优化，获得亚油酸的酿酒酵母工程菌株。
[0009]进一步，亚油酸合酶基因FAD2编码蛋白质的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.2。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的亚油酸合酶基因的亚油酸合酶基因的克隆方法，亚油酸合酶基因的克隆方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，提取红酵母总RNA并反转录成cDNA；
[0012]步骤二，以cDNA为模板设计特异性引物，通过PCR扩增亚油酸合酶基因；
[0013]步骤三，通过琼脂糖凝胶电泳和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤二中的PCR产物进行回收并纯化，得到亚油酸合酶基因FAD2片段。
[0014]进一步，步骤二中，采用2x Phanta Max MasterMix高保真DNA聚合酶进行PCR扩增；PCR扩增体系为：2x Phanta Max Master Mix 10μL，正反向引物各0.5μL，ddH2O 8μL，模板1μL，总反应体系20μL；PCR扩增反应条件为：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃1min，32循环；72℃5min。
[0015]本专利技术的另一目的在于提供一种实施所述的亚油酸合酶基因的亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法，亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法包括：以酿酒酵母为出发菌株，酿酒酵母为酿酒酵母BY4741，敲除FAA4和FAA1基因，过表达TGL1、TGL3、TGL5和FAD2基因；其中，TGL1基因整合到FAA4基因位点；TGL3和TGL5基因整合到FAA1基因位点；FAD2基因与组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，整合到NDT80位点。
[0016]进一步，亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法包括以下步骤：
[0017](1)利用重叠PCR构建模块I～模块VII；
[0018](2)构建菌株P01：将表达模块II转化酿酒酵母BY4741菌株，利用酵母缺陷型培养基SD
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HIS筛选培养，得到菌株P01；
[0019](3)构建菌株P02：将表达模块V转化酿酒酵母P01菌株，利用酵母缺陷型培养基SD
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HIS
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URA筛选培养，得到菌株P02；
[0020](4)构建菌株P03：将表达模块VII转化酿酒酵母P02菌株，利用酵母缺陷型培养基SD
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HIS
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URA
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LEU筛选培养，得到亚油酸酿酒酵母工程菌株。
[0021]进一步，步骤(1)中的模块I～模块VII的构建包括：
[0022]1)将基因TGL1、组成型启动子PGK1p和终止子ADH1t重叠，构建PGK1p
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TGL1
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ADH1t表达模块，命名为模块I；
[0023]2)将模块I与HIS筛选标记重叠，构建HIS
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I表达模块，命名为模块II；
[0024]3)将基因TGL3、组成型启动子PGK1p和终止子ADH1t重叠，构建PGK1p
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TGL3
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ADH1t表达模块，命名为模块III；
[0025]4)将基因TGL5组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，构建TEF1p
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TGL5
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CYC1t表达模块，命名为模块IV；
[0026]5)将模块III、IV和筛选标记URA重叠，构建URA
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III
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IV表达模块，命名为模块V；
[0027]6)将基因FAD2与组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，构建表达模块TEF1p
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FAD2
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CYC1t，命名为模块VI；
[0028]7)将模块VI与筛选标记LEU重叠，构建表达模块LEU
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VI，命名为模块VII。
[0029]进一步，TGL1、TGL3和TGL5基因从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，TGL1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，TGL3基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，TGL5基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
[0030]PGK1p、TEF1p为启动子序列，从酿酒酵母BY4741基因组克隆得到，PGK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚油酸合酶基因，其特征在于，亚油酸合酶基因为FAD2，亚油酸合酶基因FAD2的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。2.如权利要求1所述的亚油酸合酶基因，其特征在于，亚油酸合酶基因FAD2编码蛋白质的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.2。3.一种实施如权利要求1～2任意一项所述的亚油酸合酶基因的亚油酸合酶基因的克隆方法，其特征在于，从红酵母菌株中克隆得到一个新的亚油酸合酶基因，将其转入酿酒酵母菌株中，经脂肪酸生物合成相关代谢途径的优化，获得亚油酸的酿酒酵母工程菌株。4.如权利要求3所述的亚油酸合酶基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，提取酵母总RNA并反转录成cDNA；步骤二，以cDNA为模板设计特异性引物，通过PCR扩增亚油酸合酶基因；步骤三，通过琼脂糖凝胶电泳和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对步骤二中的PCR产物进行回收并纯化，得到亚油酸合酶基因FAD2片段。5.如权利要求3所述的亚油酸合酶基因的克隆方法，其特征在于，步骤二中，采用2xPhantaMaxMasterMix高保真DNA聚合酶进行PCR扩增；PCR扩增体系为：2xPhantaMaxMasterMix10μL，正反向引物各0.5μL，ddH2O8μL，模板1μL，总反应体系20μL；PCR扩增反应条件为：95℃3min；95℃15s，60℃15s，72℃1min，32循环；72℃5min。6.一种实施如权利要求1～2任意一项所述的亚油酸合酶基因的亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，亚油酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法包括：以酿酒酵母为出发菌株，酿酒酵母为酿酒酵母BY4741，敲除FAA4和FAA1基因，过表达TGL1、TGL3、TGL5和FAD2基因；其中，TGL1基因整合到FAA4基因位点；TGL3和TGL5基因整合到FAA1基因位点；FAD2基因与组成型启动子TEF1p和终止子CYC1t重叠，整合到NDT80位点。7.如权利要求6所述的亚油酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，亚油酸酿酒酵母工程菌株的构建方法包括以下步骤：(1)利用重叠PCR构建模块I～模块VII；(2)构建菌株P01：将表达模块II转化酿酒酵母BY4741菌株，利用酵母缺陷型培养基SD
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HIS筛选培养，得到菌株P01；(3)构建菌株P02：将表达模块V转化酿酒酵母P01菌株，利用酵母缺陷型培养基SD
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HIS
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URA筛选培养，得到菌株P02；(4)构建菌株P03：将表达模块VII转化酿酒酵母P02菌株，利用酵母缺陷型培养基SD
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HIS
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URA
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LEU筛选培养，得到生物合成亚油酸的酿酒酵母工程菌株P03。8.如权利要求7所述的亚油酸酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中的模块I～模块VII的构建包括：1)将基因TGL1、组成型启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：王国丽，李德芳，安天悦，洪盼，李明凯，马梦雨，高豪男，郑秋生，
申请(专利权)人：滨州医学院，
类型：发明
国别省市：