BsER烯还原酶及其突变体的构建及应用制造技术

本发明专利技术提出了BsER烯还原酶及其突变体的构建及应用，属于生物技术领域；BsER烯还原酶来源于枯草芽孢杆菌，氨基酸序列为SEQ ID NO.1；以BsRE烯还原酶及其突变体作为催化剂，加入辅因子，形成的反应体系，可得到光学纯的(R)

【技术实现步骤摘要】
BsER烯还原酶及其突变体的构建及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及BsER烯还原酶及其突变体的构建及应用。

技术介绍

[0002]生物催化技术是利用酶或者生物有机体作为催化剂来进行化学转化的方法，是生物制造的重要基础，具有反应条件温和、选择性高等优点。近年来生物催化逐步成为制造手性化学品、药品及其中间体的关键技术，通过生物催化来建立一条经济性好、选择性高的高效合成路线是非常重要的技术手段。酶作为生物催化剂，在绿色化学和医药领域得到广泛的应用。
[0003]光学纯的Hajos
‑
Parrish酮、Wieland
‑
Miescher酮及其衍生物可作为合成多种化合物，如类固醇、萜烯、紫杉醇、雌激素酮、法西亭碱、氯内酯A等一系列有价值天然产物的骨架或中间体，也可用于制备抗癌药物、抗菌剂和HIV蛋白酶阻滞剂。
[0004][0005]利用生物催化酶动力学拆分底物Hajos
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Parrish酮、Wieland
‑
Miescher酮具有选择性高、反应条件温和等优点。据报道，H.Hioki等人利用酵母生物催化酮还原实现底物拆分，以获得高对映体的(R)
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1b(ee>99％)，而(R)
‑
1a的选择性较低(ee＝59％)。(H.Hioki et al.Tetrahedron:Asymmetry.2000,11,829
‑
834.)；T.Janeczko等人利用菌株Didymosphaeria igniaria获得了对映选择性(R)
‑
1a和(R)
‑
1b，ee值分别为98％和100％。(T.Janeczko et al.World J.Microbiol.Biotechnol.2010,26,2047
‑
2051.)，所使用的菌株无法进行改造。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提出BsER烯还原酶及其突变体的构建及应用，本专利技术通过设计突变，预测蛋白质与底物作用的空间构型，通过重叠延伸PCR方法进行突变体构建，从而获得烯还原酶BsER的突变库，通过检测产物的选择性和转化率筛选高立体选择性和催化活性的烯还原酶；同时运用烯还原酶不对称催化其酮还原衍生物(1S,7aS)
‑
3a、(1S,8aS)
‑
3b，从而得到含有多个立体中心的产物，为有价值化合物的合成提供对映体纯的反应砌块或中间体。
[0007]本专利技术为解决上述问题采用下述方案：
[0008]本专利技术提出的一种BsER烯还原酶，所述BsER烯还原酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述BsER烯还原酶为通过NCBI数据库基因挖掘得到，来自枯草芽孢杆菌；
[0009]以BsER烯还原酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1作为模板，进行定点突变，得到烯还原酶突变体；所述烯还原酶突变体的氨基酸序列具有以下至少一个突变位点，所述烯还原酶
突变体的氨基酸序列的突变位点包括第30位、第32位、第72位、第106位、第233位和第262位，其中，第30位突变为A/V/S/C/G，第32位突变为A/V/S/C/G/I/L，第72位突变为A/V/S/C/G/Y/W，第106位突变为A/V，第233位突变为A/V/S/C/G/I/L/Y，第262位突变为A/V/S/C/G/I/L/Y。其中烯还原酶突变体氨基酸序列和核酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.86。本专利技术通过重组工程菌的构建及培养表达，构建E.coli Rosetta2(DE3)
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pET28b_NhisMBP
‑
BsER菌株，获得BsER烯还原酶及烯还原酶突变体，具体步骤如下：
[0010](1)将来源于枯草芽孢杆菌的BsER烯还原酶经基因克隆后连入表达质粒pET28b_NhisMBP上，将连有烯还原酶目的基因的重组质粒转到感受态细胞E.coli Rosetta2(DE3)中，得到重组工程菌；
[0011](2)阳性克隆筛选：将重组工程菌划线到含有卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，37℃过夜培养。挑单克隆菌株的一半进行菌落PCR验证条带大小是否与目的基因一致；
[0012](3)菌种培养及表达：挑适量单克隆菌株于4mL LB液体培养基中过夜培养，后转接到100mL LB液体培养基中，37℃震荡扩大培养，OD600数值达到0.6时加入IPTG在15
‑
30℃低温诱导表达培养12h。
[0013]含有BsER烯还原酶及其突变体编码基因的大肠杆菌工程菌，经发酵培养表达后收集得到的菌体，经超声破碎后12000rpm/min离心提取粗酶液、以粗酶液为生物催化剂，在pH＝7的KH2PO4和K2HPO4缓冲体系下，在30
‑
37℃，100
ꢀ‑
300rpm震荡条件下反应12
‑
24h，反应液用乙酸乙酯或二氯甲烷1：1萃取。以rac
‑
1a为底物，获得光学纯(R)
‑
1a底物剩余和cis
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2a主要产物；以rac
‑
1b为底物，得光学纯(R)
‑
1b底物剩余和cis
‑
2b主要产物；以(1S,7aS)
‑
3a为底物，得烯还原产物(1S,3aR,7aS)
‑
4a；以(1S,8aS)
‑
3b为底物，得烯还原产物(1S,4aR,8aS)
‑
4b。
[0014]对于底物rac
‑
1a的酶催化，得到烯还原酶突变体T30S/F72W，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；对于底物rac
‑
1b的酶催化，得到烯还原酶突变体F72A/T30A，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0015]对于底物(1S,7aS)
‑
3a的烯还原催化，得到烯还原酶突变体F72W，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；对于底物(1S,8aS)
‑
3b的烯还原催化，得到烯还原酶突变体F72W/E233G，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10。
附图说明
[0016]图1为本专利技术的烯还原酶应用于不对称还原rac
‑
1a的HPLC检测图；
[0017]图2为本专利技术的烯还原酶应用于不对称还原rac
‑
1b的HPLC检测图；
[0018]图3是产物2a的GC检测图；
[0019]图4是产物2b的GC检测图；
[0020]图5为(1S,7aS)
‑
3a的还原反应的GC检测图；
[0021]图6为(1S,8aS)
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.BsER烯还原酶，其特征在于，所述BsER烯还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，所述BsER烯还原酶为通过NCBI数据库基因挖掘得到，来自枯草芽孢杆菌。2.根据权利要求1所述的BsER烯还原酶，其特征在于，以所述的BsER烯还原酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1作为模板，进行定点突变，得到烯还原酶突变体；所述的烯还原酶突变体的氨基酸序列的突变位点包括第30位、第32位、第72位、第106位、第233位和第262位，其中，第30位突变为A/V/S/C/G，第32位突变为A/V/S/C/G/I/L，第72位突变为A/V/S/C/G/Y/W，第106位突变为A/V，第233位突变为A/V/S/C/G/I/L/Y，第262位突变为A/V/S/C/G/I/L/Y；其中烯还原酶突变体的氨基酸序列和核酸序列为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.86。3.根据权利要求1或2所述的BsER烯还原酶，其特征在于，所述BsER烯还原酶及烯还原酶突变体的构建，具体步骤如下：(1)将来源于枯草芽孢杆菌的BsER烯还原酶经基因克隆后连入表达质粒pET28b_NhisMBP上，将连有烯还原酶目的基因的重组质粒转到感受态细胞E.coli Rosetta2(DE3)中，得到重组工程菌；(2)阳性克隆筛选：将重组工程菌划线到含有卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，37℃过夜培养；挑单克隆菌株的一半进行菌落PCR验证条带大小是否与目的基因一致；(3)菌种培养及表达：挑适量单克隆菌株于4mL LB液体培养基中过夜培养，后转接到100mL LB液体培养基中，37℃震荡扩大培养，OD600数值达到0.6时加入IPTG在15
‑
30℃低温诱导表达培养12h，得到菌液。4.根据权利要求1
‑
3任意一项所述的BsER烯还原酶，其特征在于，所述的BsER烯还原酶及烯还原酶突变体的应用，具体为：将含有BsER烯还原酶及烯还原酶突变体编码基因的大肠杆菌工程菌，经发酵培养表达后收集得到的菌体；将上述菌体经超声破碎后，进行离心提取，得到粗酶液；以粗酶液为生物催化剂，在KH2PO4和K2HP...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦斌，董鹤，李冬艳，游松，张文鹤，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：